磁場三相流化床酶解殼聚糖的研究.pdf

1、低聚殼聚糖具有獨特的、優(yōu)越的生理活性和功能性質(zhì)，因而，在食品保健和生物醫(yī)藥領(lǐng)域中具有巨大的開發(fā)和應(yīng)用潛力，發(fā)展前途廣闊。低聚殼聚糖可由殼聚糖通過酶降解方法制取。酶法具有環(huán)保、副產(chǎn)品少且可控性好等優(yōu)點，但普通酶法生產(chǎn)效率低、成本高，很難實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。因此，尋求一種環(huán)保、生產(chǎn)成本低而產(chǎn)率高的方法對低聚殼聚糖生產(chǎn)的研究具有重要現(xiàn)實意義。本研究以天然大分子殼聚糖在三相流化床磁生物反應(yīng)器進(jìn)行降解制取聚合度(DP)為4～16低聚殼聚糖為研究體

2、系，通過對磁性固定化纖維素酶的制備及其致磁敏學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)條件對殼聚糖降解產(chǎn)物影響的研究，了解殼聚糖的降解特性，優(yōu)化磁性固定化纖維素酶的制備工藝，揭示磁場條件下磁性固定化纖維素酶的酶反應(yīng)動力學(xué)和殼聚糖降解為低聚糖的規(guī)律，探討磁場對酶降解殼聚糖的強(qiáng)化機(jī)理。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 一、磁性殼聚糖微球的制備及其表征以戊二醛為交聯(lián)劑、采用反相懸浮交聯(lián)技術(shù)合成了磁性殼聚糖微球。利用數(shù)碼光學(xué)顯微成像儀、激光粒度儀、傅立葉紅外光譜(FTIR)

3、、原子吸收分光光度計、磁天平和可調(diào)磁場現(xiàn)代分析技術(shù)對微球的形態(tài)、大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)及磁響應(yīng)性進(jìn)行了表征，結(jié)果表明，本研究合成磁性殼聚糖微球的平均粒徑為1251μm、內(nèi)部均勻分布著Fe3O4，具有良好的磁響應(yīng)性，在外磁場作用下，微球能夠快速沉降，為酶的固定化及其在磁場流化床的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。 二、磁性固定化纖維素酶的制備及其工藝優(yōu)化采用物理吸附法將纖維素酶固定在磁性殼聚糖微球上，用RSM分析法對制備磁性固定化纖維素酶的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)

4、化，得到了最優(yōu)工藝參數(shù)為：固定化時間12h、pH值5.2、離子濃度0.066：mol·L-1、酶用量202.7mL。最優(yōu)條件下得到的最大酶活力為28.5IU.g-1。通過考察不同溫度、不同pH下固定化酶酶活力的變化，得到最適溫度和pH分別為50℃和4.5。采用對照法比較了磁性固定化酶與游離酶在外加徑向磁場作用下的酶活力的變化，結(jié)果顯示：當(dāng)磁場作用時間＜60min時，游離酶和固定化酶的酶活隨著磁場作用時間的增加而增加，當(dāng)磁場作用時間超過6

5、0min，游離酶酶活快速下降，而固定化酶酶活僅略下降，表明制備的固定化酶酶活穩(wěn)定性較好。 三、磁場三相流化床反應(yīng)器中磁性固定化纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)以磁性固定化纖維素酶酶活力的變化為指標(biāo)，研究了磁場強(qiáng)度、磁場作用時間、溫度、表觀氣速和表觀液速對其活性的影響。結(jié)果表明：無論施加磁場與否，溫度均有助于促進(jìn)酶的活性；不同磁場的作用對酶活力的影響不同，以加載脈沖磁場效果最好；在一定磁場強(qiáng)度作用下，考察固定化酶酶活力的變化規(guī)律，找出在保持固定

6、化酶顆粒處于流態(tài)化下殼聚糖酶解效果最佳Ug和U1分別為50 mL/min和20 mL/min。采用RSM響應(yīng)面分析法和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實驗得出流化床最優(yōu)操作參數(shù)為： Ug、U1、H和磁場作用時間t分別為55.1 mL/min、23.1 mL/min、1.7 kA/m、26min。 四、磁場三相流化床的研制及其流動特性的研究以電磁學(xué)理論和流態(tài)化理論為基礎(chǔ)研制出磁場三相流化床酶反應(yīng)器，可實現(xiàn)穩(wěn)恒、交變和脈沖三種磁場的轉(zhuǎn)換?？?/p>

7、察磁場強(qiáng)度對床層特性的結(jié)果顯示：當(dāng)H＜0.5KA/m時，床層表現(xiàn)為散流區(qū)；當(dāng)0.5kA/m＜H＜7.5kA/m時，床層處于鏈流區(qū)；當(dāng)H＞7.5KA/m時，床層處于磁聚區(qū)；考察了磁場強(qiáng)度對三相流化床起始流動狀態(tài)的影響，結(jié)果表明，一定范圍內(nèi)，Ugmf和Ugmf隨H的增大而增大。 五、磁場三相流化床條件下磁性固定化纖維素酶反應(yīng)動力學(xué)的研究采用Lineweaver-Burk方法，研究了以濃度為1～5mg/mL的大分子殼聚糖為底物，磁性固

8、定化纖維素酶酶反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果顯示：穩(wěn)恒、交變和脈沖三種磁場作用下，Km值隨磁場強(qiáng)度的增加而增加，表明酶對殼聚糖底物的親和力下降；應(yīng)用雙膜模型Sh=2.0+0.6dpuPL/μL1/2.μL/PLD1/3=KL.Pd/D理論，初步探討了酶反映動力學(xué)的變化機(jī)理。以濃度為5～25mg/mL的殼聚糖為底物，固定化酶反應(yīng)速率與底物濃度的動力學(xué)變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，一定底物濃度范圍內(nèi)，一定表觀氣速和液速條件下，磁場的施加可以提高酶反應(yīng)速率；而且發(fā)現(xiàn)在H=

9、1.5kA/m的相同磁場強(qiáng)度下，以脈沖磁場處理條件下的反應(yīng)速率最大。 六、磁場三相流化床條件下殼聚糖的降解特性及其機(jī)理探討采用LVD-I+型旋轉(zhuǎn)粘度計研究了初始底物濃度、表觀氣速、磁場形式對殼聚糖反應(yīng)液粘度的影響。結(jié)果表明，固定化纖維素酶是通過內(nèi)切方式作用于殼聚糖分子的β-1,4-糖苷鍵，使其分子鏈斷裂，降解為低分子量物質(zhì)。 采用HPLC法對DP＜8的殼聚糖水解產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果顯示，在H=1.5kA/m磁場作用

10、下，當(dāng)反應(yīng)時間為150min時，五聚糖和六聚糖的總含量最高，且脈沖磁場作用下的殼聚糖降解產(chǎn)率是對照樣品的1.5倍，表明施加磁場有利于促進(jìn)酶解反應(yīng)；并應(yīng)用達(dá)姆科勒準(zhǔn)數(shù)(Da)探討了殼聚糖降解的機(jī)理，指出在實際中如果控制通過適當(dāng)控制，創(chuàng)造Da值較大的條件，則有可能得到較高C(5+6)。 應(yīng)用FTIR和X-Ray現(xiàn)代方法對8＜DP＜16的低聚殼聚糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，F(xiàn)TIR．圖結(jié)果說明，殼聚糖酶降解前后，其分子基本結(jié)構(gòu)并沒有改變，只是