shRNA靶向抑制NF-κB基因治療食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的研究.pdf

1、背景:
　　子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)是育齡期婦女中十分常見的婦科疾病，發(fā)病率大約在10％-15％，因其能夠引起嚴重的臨床癥狀，如下腹痛、痛經(jīng)、性交痛、不孕等，對廣大婦女的心身健康造成極大的影響。當今隨著大眾健康意識的提高，發(fā)病率有逐年上升的趨勢。自從19世紀該病報導以來，雖然經(jīng)過對該病一個多世紀的研究，其發(fā)病機制仍不清楚?？v觀各大學說，如子宮內(nèi)膜種植學說、體腔上皮化生學說、淋巴和靜脈播散學說及近期報道的干

2、細胞學說、血管形成學說、在位內(nèi)膜決定論學說、內(nèi)分泌及免疫學說等，均只能部分揭示該疾病的發(fā)生發(fā)展過程，仍無法系統(tǒng)的揭示其全面的發(fā)病機制，所以對子宮內(nèi)膜異位癥的治療目前仍無較好的方案。然而，無論何種學說，異位子宮內(nèi)膜的生長必須經(jīng)過黏附、侵襲及血管生成這3個環(huán)節(jié)，因此，如能阻斷其中的某一過程，就能抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。
　　子宮內(nèi)膜異位癥雖然為良性疾病，但其具有類似腫瘤的特性，如子宮內(nèi)膜異病灶可在盆腹腔內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，形成相應的病變

3、。目前，針對子宮內(nèi)膜異位癥的治療主要集中在激素類藥物及手術治療，但治療效果均不理想，復發(fā)率較高，因此，尋找新的治療方法顯得尤為重要，目前，基因治療已逐漸成為一種新的治療策略。研究顯示，核因子кB(NF-кB)作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，最早發(fā)現(xiàn)于B淋巴細胞內(nèi)，因其可與免疫球蛋白輕鏈基因增強子кB結合而被命名為NF-кB，其家族中有五個成員(RelA(p65)、RelB、c.Rel、NF-кB1（p50和它的前體p105）和NF-к B2（p52

4、和它的前體p100）），該因子廣泛存在于各種組織細胞中，正常情況下該因子以同源或者異源二聚體的形式與抑制蛋白IкB結合而存在于胞漿中，受激活因子刺激激活后，與IкB分離進入細胞核內(nèi)調(diào)控目的基因的合成。目前發(fā)現(xiàn)，該因子在調(diào)控細胞增殖、血管形成、炎性反應、細胞凋亡等生理病理過程中起著非常重要的作用。有文獻報道，該因子與乳腺癌、前列腺癌、肺癌、直腸癌、宮頸癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展及預后過程均存在一定的相關性;同時，也有文獻報導NF-кB也參與子宮

5、內(nèi)膜異位癥的病理生理過程。本課題組通過前期在裸鼠體內(nèi)的試驗也證實，NF-кB在裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，抑制NF-кB基因表達后，異位病灶明顯萎縮，微血管密度明顯減小。但裸鼠畢竟是低等動物，很多生理功能與人類差距很大，因此，本研究采用與人類最接近的大型靈長類動物作為實驗對象，通過RNA干擾技術，短發(fā)夾狀RNA（shRNA）靶向抑制NF-кB基因的表達，觀察其對靈長類動物子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶發(fā)生發(fā)展的影響，初步評估其對

6、食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的體內(nèi)治療效果及其安全性。
　　目的:
　　1.通過體外手術方法構建食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型，并觀察該建模手術的效果，為構建大型靈長類動物子宮內(nèi)膜異位癥模型增加更多的選擇。
　　2.體外培養(yǎng)食蟹猴在位子宮內(nèi)膜細胞，同時合成高特異性靶向NF-кB基因的shRNA腺病毒載體，利用該病毒載體干預原代培養(yǎng)的食蟹猴子宮內(nèi)膜細胞，通過比較實驗組及對照組之間的凋亡細胞數(shù)目及凋亡蛋白的表達情況，評估其對體外培養(yǎng)的食

7、蟹猴子宮內(nèi)膜細胞的增殖活動是否具有直接的抑制效應。
　　3.成功構建食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型后，利用前期合成的NF-кB-shRNA腺病毒載體，對內(nèi)異病灶進行直接注射，通過靶向抑制子宮內(nèi)膜異位癥NF-кB基因的表達后，觀察在干預后各組內(nèi)異位病灶在微血管密度、細胞核增殖抗原(PCNA)及NF-кB表達等的改變，評估其在治療食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察其遠期毒副作用。
　　方法:
　　1.選擇15只健康、體

8、重相近、月經(jīng)周期規(guī)律的雌性食蟹猴，分成實驗組及對照組，實驗組12只，對照組3只，術前進行六個月經(jīng)周期的觀察，排除不健康食蟹猴。
　　2.在月經(jīng)周期的第8-15天，雌激素高峰的第3-5天，實驗組行手術獲取子宮內(nèi)膜組織，分別種植到自體盆腔大網(wǎng)膜、子宮直腸窩、子宮表面等處;對照組以大網(wǎng)膜組織代替子宮內(nèi)膜組織種植到相同的位置。
　　3.分別于手術后第8周及第16周月經(jīng)周期的第8-15天行腹腔鏡探查，取可疑病灶行組織病理學檢查，觀察內(nèi)

9、異病灶鏡下有無子宮內(nèi)膜樣腺體結構及間質(zhì)細胞。
　　4.設計攜帶有NF-кB-p65基因的shRNA腺病毒載體及相應空載shRNA腺病毒載體，并進行體外合成。
　　5.手術獲取新鮮食蟹猴子宮內(nèi)膜組織，體外進行食蟹猴子宮內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)，分成實驗組及對照組。實驗組轉(zhuǎn)染攜帶NF-кB-p65 shRNA的腺病毒，對照組轉(zhuǎn)染攜帶空載shRNA腺病毒載體，然后進行共培養(yǎng)。比較兩組之間凋亡蛋白的表達及細胞周期的變化情況。
　　6.

10、準備好構建成功的食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥動物模型及高特異性的靶向NF-кB基因的shRNA腺病毒及其陰性對照空載shRNA腺病毒。
　　7.將建模成功的食蟹猴分成實驗組、陰性對照組及單純建模組，將NF-кBshRNA腺病毒在腹腔鏡下直接注入實驗組食蟹猴子宮內(nèi)膜異位病灶內(nèi)，陰性對照組在病灶內(nèi)注射空載shRNA腺病毒，單純建模組病灶內(nèi)注射生理鹽水。
　　8.注射腺病毒后4周，腹腔鏡下觀察病灶變化，取各組子宮內(nèi)膜異位病灶進行CD34免

11、疫組化染色檢測微血管密度，并采用蛋白印跡法(western blot)檢測NF-кB及增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白的表達，6個月后處死各組食蟹猴，觀察各重要臟器的遠期副作用。
　　9.統(tǒng)計學分析:本實驗所有數(shù)據(jù)計量資料均采用均數(shù)±標準差((x)±SD)描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準均為α=0.05。
　　結果:
　　1.術前對食蟹猴精神狀態(tài)、食欲、睡眠情況和月經(jīng)周

12、期的觀察:通過近六個月經(jīng)周期的觀察，發(fā)現(xiàn)所有食蟹猴精神均良好，無嗜睡、困怠的現(xiàn)象，觀察期間，食蟹猴睡眠、食欲均良好。所有食蟹猴均有規(guī)律的月經(jīng)周期，時間大概28-30天左右，行經(jīng)4-5天，與正常婦女月經(jīng)周期類似。
　　2.術后第8周探查顯示，15只實驗猴中，5只盆腔內(nèi)膜種植處肉眼可見疑似異位內(nèi)膜病灶改變，5只形成異位囊腫，另外2只種植處肉眼未見異位病灶存在，可疑病灶行組織病理檢查可見完整腺體和間質(zhì)細胞結構。3只對照組食蟹猴未見可疑病

13、灶，取組織活檢未見整腺體和間質(zhì)細胞結構。術后第16周，再次行腹腔鏡探查，肉眼仍可見子宮內(nèi)膜異位病灶，并且存在不同程度的盆腔粘連，異位內(nèi)膜生長情況與術后第8周基本相似。
　　3.成功合成了高特異性的腺病毒載體，對腺病毒載體進行PCR和測序結果與預期結果一致，經(jīng)包裝產(chǎn)生的病毒滴度為1.58×1011U/ml。
　　4.NF-кB-p65 shRNA腺病毒感染食蟹猴子宮內(nèi)膜細胞后，實驗組子宮內(nèi)膜細胞凋亡蛋白的表達水平明顯高于對照組

14、，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);實驗組進入細胞分裂期細胞數(shù)明顯少于對照組。
　　5.實驗組食蟹猴異位病灶較前萎縮，其微血管密度(0.00198±0.0003)較陰性對照組(0.02189±0.0026)、單純建模組(0.02451±0.0033)明顯減小，分別比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。實驗組食蟹猴NF-кB蛋白的表達水平(0.338±0.174)較陰性對照組(0.678±0.021)、單純建模組(0.645±0

15、.098)明顯下降，分別比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。實驗組食蟹猴PCNA蛋白的表達水平(0.37±0.17)低于陰性對照組(0.57±0.26)、單純建模組(0.57±0.28)，分別比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　結論:
　　1.此次研究根據(jù)種植學說原理在國內(nèi)首次成功構建了食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥動物模型，為以后子宮內(nèi)膜異位癥在食蟹猴的研究提供了理論基礎，為子宮內(nèi)膜異位癥在非人靈長類動物模型的研究領域

16、增加了新的動物選擇，并不是所有食蟹猴能成功構建子宮內(nèi)膜異位癥模型提示個體遺傳、免疫等其他因素亦可能影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。
　　2.攜帶NF-кB基因的腺病毒體外感染食蟹猴子宮內(nèi)膜細胞后可加速子宮內(nèi)膜細胞的凋亡，并抑制子宮內(nèi)膜細胞的增殖，為后期該基因在食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥模型上的研究提供理論基礎。
　　3.NF-кB shRNA通過靶向抑制NF-кB基因的表達后，能夠抑制食蟹猴子宮內(nèi)膜異位癥的進展，抑制子宮內(nèi)膜異位病灶的血