土壤及海底沉積物中可培養(yǎng)與未可培養(yǎng)粘細菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究.pdf

1、粘細菌(Myxobacteria)是一類革蘭氏陰性滑動細菌。粘細菌由于具有復(fù)雜的細胞社會行為和能形成多細胞聚集、形態(tài)特異的子實體結(jié)構(gòu)而被視為“高等細菌”。具有鮮明色彩的子實體是在環(huán)境條件惡劣或營養(yǎng)條件貧瘠的情況下，由成千上萬的營養(yǎng)細胞聚集并分化發(fā)育而成的。由于粘細菌子實體及其內(nèi)含粘孢子的抗逆性，粘細菌能夠廣泛地分布在地球的各個地方，特別在土壤、腐木、樹皮和動物糞便中最為普遍。但是粘細菌的生態(tài)學研究明顯滯后于其它土壤微生物，這是因為粘細菌

2、的許多特殊性狀使得粘細菌的分離與純化相對于其它細菌更為耗時和困難；同時，由于粘細菌子實體結(jié)構(gòu)容易退化和丟失，因此傳統(tǒng)的粘細菌分離純化方法容易遺漏粘細菌菌株。因此，分離到的可培養(yǎng)粘細菌可能只是代表了自然環(huán)境中粘細菌類群的一小部分。隨著不依賴培養(yǎng)(Cultivation Independent)方法的完善和發(fā)展，研究者已經(jīng)有能力對環(huán)境中那些行使重要功能但至今無法培養(yǎng)的微生物進行群落組成和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面的分析：同時隨著公共核酸數(shù)據(jù)庫Gen

3、Bank中粘細菌16S rRNA基因序列的快速、大量增加也使我們通過分子生物學方法分析環(huán)境中粘細菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性成為可能。在本研究中，我們利用粘細菌傳統(tǒng)的分離純化方法以及分子生態(tài)學方法來研究土壤及海底沉積物中粘細菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其生態(tài)多樣性。 1. 我們從實驗室粘細菌資源菌庫中選取了37株粘細菌菌株進行形態(tài)鑒定和菌株親緣關(guān)系的分析。粘細菌的形態(tài)特征，尤其是子實體形態(tài)是粘細菌種屬分類的主要依據(jù)，但由于子實體結(jié)構(gòu)經(jīng)過傳代培養(yǎng)很容

4、易退化甚至是丟失，給這些菌株的準確分類帶來了很大的困難，如本研究中的孢囊桿菌亞目(Cystobacterineae)菌株0082-2、0085-4、0121-3、Myx9736和NM03以及堆囊菌亞目(Sorangineae)菌株So0007-16、So0157-52和So139-5的子實體結(jié)構(gòu)都發(fā)生了不同程度的退化。通過對菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，能夠提高傳統(tǒng)形態(tài)分類的準確性。在本研究中，通過對孢囊桿菌亞目15

5、株菌株和堆囊菌亞目22株菌株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析表明，大多數(shù)的粘細菌屬在系統(tǒng)進化樹上能形成各自獨立的分支。說明在屬及屬以上水平，粘細菌形態(tài)分類和16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有較好的一致性。但在種水平上16S rRNA基因序列所揭示的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可靠性較低。在此，我們使用了HSP60(groEL)基因序列來分析粘細菌近緣菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在本研究中，我們得到了孢囊桿菌亞目5株菌株和堆囊菌亞目堆囊菌屬

6、(Sorangium)22株菌株的groEL1部分基因序列。通過分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，groEL1基因能夠更為準確的揭示粘細菌種屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，彌補了16S rRNA基因序列在鑒定粘細菌種屬中的不足。同時發(fā)現(xiàn)粘細菌具有重復(fù)拷貝的HSP60基因，并擴增得到了9株堆囊菌屬菌株的groEL2基因。通過分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)，groEL2基因也可以作為堆囊菌屬內(nèi)系統(tǒng)進化分析的分子標記，且相同菌株不同拷貝的groEL基因序列同源性都在78％左右

7、，這暗示著重復(fù)拷貝的groEL基因來源于同一個祖先基因，但卻表現(xiàn)出明顯不同的進化速率。 2.利用本研究得到的37個粘細菌菌株16S rRNA基因序列和70個GenBank中已公布的粘細菌16S rRNA基因序列信息來設(shè)計粘細菌亞目水平特異的寡核苷酸引物/探針，以從SDU土樣中提取的總DNA為模板，建立了W1/1492R和W4/1492R兩個類型文庫來分別富集孢囊桿菌亞目和堆囊菌亞目的粘細菌相關(guān)序列，通過粘細菌特異探針W2和W5雜交篩選陽

8、性克隆并測序以分析土壤中粘細菌組成多樣性。在SDU土壤樣品中，我們從富集平板上分離到了7株粘細菌菌株，但分析土壤16S rRNA基因序列說明土壤中可能存在著大量的粘細菌類群，能出現(xiàn)在富集平板上的粘細菌只代表了土壤中粘細菌類群的一小部分。在孢囊桿菌亞目，可培養(yǎng)粘細菌序列只能被分為4個分支。然而，我們分析土壤中未可培養(yǎng)粘細菌序列發(fā)現(xiàn)至少存在12個分支，包括上述己知的4個分支；在堆囊菌亞目，至少存在著5個分支，所有已報道的堆囊菌亞目菌株都位于

9、分支I內(nèi)，另外4個分支都由未可培養(yǎng)的粘細菌序列組成。 3.通過上述環(huán)境DNA技術(shù)的方法發(fā)現(xiàn)土壤生境中存在大量未可培養(yǎng)粘細菌，但該方法是基于DNA水平，不能說明這些未可培養(yǎng)粘細菌的狀態(tài)。因此我們又進一步從土壤RNA出發(fā)，通過建立孢囊桿菌亞目和堆囊菌亞目富集的粘細菌16S crDNA文庫，并利用特異探針W2和W5進行了文庫的篩選和測序分析。我們得到了83個活性粘細菌的16S crDNA序列。進一步比較可培養(yǎng)粘細菌、基于土壤DNA的分

10、子生態(tài)數(shù)據(jù)和基于土壤RNA的分子生態(tài)數(shù)據(jù)顯示，盡管傳統(tǒng)分離方法只能發(fā)現(xiàn)7株粘細菌菌株，但環(huán)境中存在著大量具有代謝活性的未可培養(yǎng)粘細菌，這也說明了我們所使用的傳統(tǒng)分離方法的局限性。而且結(jié)果顯示，這些活躍代謝表達的粘細菌類群，不但與我們通過傳統(tǒng)分離方法得到的粘細菌菌株不一致，也和我們通過DNA水平出發(fā)得到的結(jié)果有較大的出入。進一步說明了無論是分離到的粘細菌菌株還是DNA水平得到的粘細菌序列都不能真實地反映在生境中具有較高代謝活性、行使生態(tài)功

11、能的活性粘細菌類群的組成。 4.粘細菌通常被認為是土壤微生物，但是近幾年，海洋嗜鹽粘細菌和海洋耐鹽粘細菌都陸續(xù)地被發(fā)現(xiàn)。在本研究中，以來自不同海底深度的10個海底沉積物樣品為研究材料，利用傳統(tǒng)的分離純化方法進行可培養(yǎng)海洋粘細菌的分離，但并沒有發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)粘細菌的存在，說明在海底沉積物中形成子實體的可培養(yǎng)粘細菌非常之少。為了了解海底沉積物中細菌的群落結(jié)構(gòu)以及粘細菌在細菌群落中的豐度情況，我們分別對853m和4794m深度的海底沉積物樣品91

12、6-1和7K367 M2-1構(gòu)建了細菌普通16S rRNA基因文庫，并隨機選取這兩個文庫的克隆子進行測序，分別得到了88個和93個序列。分析這些序列表明，位于4794m的7K367 M2-1海底沉積物中沒有粘細菌相關(guān)的序列發(fā)現(xiàn)，說明在7K367M2-1海底沉積物中粘細菌占細菌總數(shù)的比例較低(小于1％);而位于853m的916-1海底沉積物中，發(fā)現(xiàn)了3個粘細菌相關(guān)序列，占細菌總數(shù)的3.4％，說明在海底沉積物916-1中粘細菌占細菌總數(shù)的比

13、例并不像土壤中的情況那樣比例較低(SDU土壤中粘細菌占細菌總數(shù)不到1％)。 隨后，我們分別對5個不同深度的海底沉積物樣品建立了W1/1492R和W4/1492R兩個類型的粘細菌富集文庫，但對文庫進行雜交篩選并沒有發(fā)現(xiàn)陽性信號。我們認為產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是探針W2和W5都是從可培養(yǎng)陸生粘細菌的16S rRNA基因出發(fā)而設(shè)計的，而在海洋環(huán)境中存在的粘細菌可能與陸生粘細菌有很大的不同，這兩個探針不能夠覆蓋到海洋粘細菌類群中，以至于

14、不能通過探針W2和W5來篩選海洋粘細菌。因此，我們隨機挑取了各個文庫的克隆子進行測序分析。通過測序得到了68個粘細菌相關(guān)序列。分析這些序列與可培養(yǎng)粘細菌的代表菌株序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)，孢囊桿菌亞目的可培養(yǎng)粘細菌分支內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)海洋粘細菌相關(guān)序列，說明在海洋環(huán)境中孢囊桿菌亞目的可培養(yǎng)粘細菌很少，而這個亞目菌株絕大部分都是從來源于陸地環(huán)境的樣品中分離得到，說明了這類菌株比較適合在陸地環(huán)境中生存；在堆囊菌亞目中，只有來自D-030樣品的克隆

15、D030-W4-42序列位于這個分支內(nèi)，但與分支內(nèi)的其它序列同源性較低，只有91％左右。而未可培養(yǎng)海洋粘細菌主要與可培養(yǎng)海洋粘細菌SMP-2等處于一個分支內(nèi)，來自陸地的小囊菌屬(Nannocysits)內(nèi)沒有未可培養(yǎng)海洋粘細菌的發(fā)現(xiàn)。 5.為了進一步分析未可培養(yǎng)海洋粘細菌與未可培養(yǎng)陸生粘細菌、可培養(yǎng)粘細菌之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們將土壤中未可培養(yǎng)粘細菌序列和所有可培養(yǎng)粘細菌序列與未可培養(yǎng)海洋粘細菌序列進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。結(jié)果顯示，我們可

16、以將所有粘細菌序列分為4個大分支，分別代表了亞目水平的孢囊桿菌亞目、堆囊菌亞目、小囊菌亞目(Nannocyslineae)和一個新發(fā)現(xiàn)的未知亞目?？膳囵B(yǎng)陸地粘細菌分布于孢囊桿菌亞目、堆囊菌亞目和小囊菌亞目三個分支內(nèi)，但它們分布的范圍非常之小，只占了粘細菌類群的很小一部分，其它大部分是來自于未可培養(yǎng)粘細菌。我們新發(fā)現(xiàn)的未知亞目的大多數(shù)是由來自海洋的未可培養(yǎng)粘細菌組成。而小囊菌亞目的分支除了少數(shù)陸生小囊菌屬菌株序列和可培養(yǎng)海洋粘細菌外，大多

17、數(shù)是由我們得到的未可培養(yǎng)海洋粘細菌序列所組成。 本課題建立了一整套用于粘細菌系統(tǒng)分類和生態(tài)研究的分子生物學方法，在國際上首次利用分子生態(tài)學方法，對粘細菌在土壤生境中的生態(tài)分布和多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)了大量未可培養(yǎng)的粘細菌新的未知類群；同時首次利用大量海底沉積物樣品來分析海洋環(huán)境中粘細菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，取得的結(jié)果填補了粘細菌相關(guān)研究領(lǐng)域的空白，也得到了國際上權(quán)威專家的認可，使本實驗室在此領(lǐng)域處于國際領(lǐng)先水平。下一步，我們將對發(fā)現(xiàn)