基于液質聯(lián)用技術的槐角苷藥動學研究及槐角丸與連翹葉多組分分析.pdf

1、中藥槐角為豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥成熟果實。現(xiàn)代臨床藥理研究表明，槐角具有止血、抗癌、抗腫瘤、抗肥胖、抗生育、抗氧化的作用，通常用于治療高血壓和痔瘡?；苯擒帐腔苯侵泻孔罡叩囊环N黃酮成分，并且能夠水解成染料木素。中藥單體的研究，特別是對中藥單體代謝的研究，已經引起國內外越來越多的關注。中藥和天然產物的藥動學研究對于了解其活性成分的作用機理有著重要的意義。研究藥物的排泄有助于判斷藥物的療效、毒副作用，為藥物的

2、給藥方式和給藥劑量提供了一個可靠的科學依據。然而，到目前為止，關于槐角苷及其代謝物的藥動學研究和排泄研究的報道很少，槐角苷轉化為染料木素的速率直接影響著槐角苷的活性。因此，本文采用了液相色譜-質譜聯(lián)用技術(HPLC)研究槐角苷及其代謝物的藥動和排泄。
　　槐角丸，由槐角（炒）、地榆（炭）、黃芩、枳殼（炒）、當歸、防風組成。現(xiàn)代藥理和臨床研究表明，槐角丸具有止血涼血、抗癌、抗肥胖、抗高血壓的作用，被廣泛用于治療痔瘡、高血壓和牙痛。為

3、了進一步有效地使用中藥復方和提高臨床安全，需要對槐角丸的多組分進行分析測定，建立一個準確、可靠地質量控制方法。本研究首次建立了一種準確、簡單快速同時測定槐角丸中15種有效成分含量的分析方法。
　　連翹為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物連翹(Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl)的干燥果實?，F(xiàn)代藥理研究證實，連翹葉具有抑制嘔吐、保肝、抑制彈性蛋白酶、利尿作用、止痛、抗氧化、抗內毒素及

4、抗病毒的作用。連翹多為野生，資源有限，連翹葉Forsythia Folium是連翹植物的干燥葉，具有與連翹基本相同的化學成分。為了確定連翹葉合適的采收期，本實驗首次采用HPLC-MS/MS技術對14個不同采收期連翹葉中的9種主要成分進行測定，期望對連翹葉資源的開發(fā)利用提供一定的科學依據和技術支持。
　　第一部分槐角苷及其代謝物的藥動學研究
　　目的:建立了一種HPLC-MS方法同時測定大鼠灌胃給予單體槐角苷后，大鼠血漿中槐角

5、苷及其代謝物染料木素的含量，并研究其藥代動力學過程。
　　方法:色譜條件:色譜柱:DiamonsilTMC18(150 mm×4.6 mm，5μm，Dikma);流動相:甲醇(A)-水(B)（含有0.02％的甲酸）。梯度洗脫;流速:0.8 mL/min。質譜條件:多反應離子監(jiān)測(MRM)模式進行負離子檢測;內標為磺胺甲噁唑(SMZ)。大鼠灌胃給予槐角苷20 mg/kg，分別于5，15，30，45，60，90，120，180，270

6、，360 min（第一組）和1.5，3，4.5，5.5，6，7，8，9，10，11，12，18，24，36，48，72 h（第二組）眼內眥取血。樣品用乙酸乙酯液液萃取。
　　結果:該方法的精密度、準確度、檢測限、定量限、穩(wěn)定性、提取回收率和基質效應均符合要求，槐角苷及其代謝物染料木素在測定范圍內線性關系良好。藥動學研究結果表明，灌胃給予槐角苷單體后在大鼠血漿中檢測到了染料木素，驗證說明了染料木素是槐角苷的代謝產物?；苯擒盏难帩舛?/p>

7、達峰時間為48.75±7.50 min，在360 min時血藥濃度降到LLOQ，半衰期(t1/2)為59.78±7.19 min。染料木素的t1/2為103.14±16.97 min，消除速率比槐角苷慢。染料木素的AUC0-∞（954.28±168.60μg min/mL）比槐角苷的AUC0-∞（40.29±3.13μg min/mL）高出大約24倍，這說明槐角苷在體內能吸收后能很快的代謝為染料木素。染料木素的藥物濃度-時間曲線在435

8、 min和600 min處出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，最主要的原因推測可能與肝腸循環(huán)有關，有待進一步確認。
　　結論:本研究首次采用HPLC-ESI-MS法同時定性和定量分析了大鼠血漿中槐角苷及其代謝物染料木素，并成功應用于大鼠灌胃給予槐角苷后的藥代動力學研究。該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，為槐角苷的臨床應用提供了依據。
　　第二部分 HPLC-MS法測定大鼠膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物的含量
　　目的:建立一種HPL

9、C-MS法測定大鼠膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物染料木素的方法。
　　方法:色譜條件:色譜柱:DiamonsilTMC18（150mm×4.6mm，5μm，Dikma);流動相:甲醇(A)-水(B）（含有0.02％的甲酸）。梯度洗脫;流速:0.8 mL/min。質譜條件:多反應離子監(jiān)測(MRM)模式進行負離子檢測;內標為磺胺甲噁唑(SMZ)。按照20 mg/kg的劑量給SD大鼠灌胃槐角苷的羧甲基纖維素鈉混懸液，膽汁按照0-2，

10、2-4，4-6，6-8，8-12，12-24，24-30和30-36h收集，尿液按照0-2，2-4，4-8，8-12，12-24，24-36，36-48和48-72h收集，糞便按照0-4，4-8，8-10，10-12，12-24，24-36，36-48 h時間段收集。分別測定膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物的濃度。
　　結果:槐角苷原形藥物經膽汁30 h內排泄完全，排泄量主要集中在0～24 h，約占總排泄量的91.75％，經膽汁

11、排泄的排泄總量約為總給藥量的0.0111％，說明槐角苷原形藥物經膽汁排泄量較少，可能與肝的首過效應有關?；苯擒赵嗡幬锝浤蛞号判沽恐饕性?～36 h，約占總排泄量的98.05％，經尿液排泄的排泄總量約為總給藥量的1.76％;槐角苷在糞便中需要48h能排泄完全，排泄量主要集中在0～24 h，約占總排泄量的95.61％，總給藥量的11.13％。染料木素的總排泄量在膽汁中為0.42±0.02μg，尿液10.15±0.22μg，糞便2.92

12、±0.13μg，由此可見，染料木素主要通過尿液和糞便排泄，這可能與槐角苷在肝和胃腸道的代謝有關，需要進一步研究確證。
　　結論:本研究采用快速、專屬和靈敏度高的HPLC-MS法同時測定大鼠膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物染料木素的濃度，并成功應用于大鼠灌胃給予槐角苷后的排泄研究，為槐角苷的臨床應用提供了依據。
　　第三部分 HPLC-MS法同時測定槐角丸中15種成分的含量
　　目的:建立一種快速、準確、可同時測定槐角

13、丸中15種化學成分（槐角苷、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素、山柰酚、黃芩素、黃芩苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、漢黃芩素、升麻素和升麻素苷）的HPLC-MS分析方法，并用于不同于廠家的槐角丸的分析。
　　方法:采用DiamonsilTMC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm，Dikma)，柱溫30℃，以甲醇-0.03％甲酸水(v/v)溶液為流動相進行梯度洗脫，流速0.8 mL/min，進樣量10μL;采用電噴霧離

14、子源進行正負離子同時監(jiān)測，離子源溫度為650℃，多反應監(jiān)測模式(MRM)用于定量分析?；苯擒?、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素、山柰酚、黃芩素、黃芩苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、漢黃芩素、升麻素和升麻素苷的檢測離子對分別為431.2/268.0,431.2/268.2,268.7/133.0,609.3/301.0,301.0/150.9,284.6/92.9,269.3/65.1,445.4/268.7,579.3/150.9

15、,271.2/150.9,609.4/301.2,609.5/301.1,285.2/270.1,307.1/259.2和469.4/307.2。
　　結果:槐角苷中15種成分在30 min內可完全分離;峰面積與濃度線性關系良好;加樣回收率為97.25％-102.8％，精密度RSD為0.14％-2.55％。聚類分析對40批槐角丸樣品分類區(qū)分，來自同一個廠家的樣品被分為同一類，而不同廠家生產的藥品存在著明顯的差異。
　　結論:

16、首次建立HPLC-MS法同時定性和定量分析槐角丸中15種成分的含量。該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于槐角丸的質量控制。
　　第四部分 HPLC-MS法測定不同采收期連翹葉中9種成分的含量
　　目的:建立HPLC-MS法同時測定連翹葉中連翹苷、連翹脂素、連翹酯苷A、連翹酯苷F、蘆丁、槲皮素、異槲皮苷、綠原酸、(+)-表松脂素-4'-O-葡萄糖苷的量。
　　方法:采用Dikma Diamonsil C18色譜柱

17、(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫30℃，以甲醇-0.02％甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，體積流量0.8 mL/min，進樣量10μL;采用電噴霧離子源，進行負離子模式監(jiān)測，多反應監(jiān)測模式(MRM)用于定量分析，源噴射電壓為-4500V，離子源溫度為650℃。
　　結果:9種化學成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內均具有良好的線性關系，加樣回收率為97.20％～101.2％，精密度RSD為0.54％～1.24％。