生物人工腎的優(yōu)化構(gòu)建及其治療多器官功能障礙綜合征的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:血液凈化療法是急性腎衰竭(ARF)合并多器官功能障礙綜合征(MODS)最常用的治療方法。但ARF合并MODS死亡率仍居高不下，這與目前血液凈化技術(shù)僅能替代腎小球?yàn)V過(guò)功能，而不具備替代腎小管的功能，不能完成免疫、重吸收、內(nèi)分泌及代謝等功能密切相關(guān)。生物人工腎小管(RAD)就是利用細(xì)胞治療學(xué)和組織工程技術(shù)構(gòu)建出的一種裝置，以補(bǔ)充、完善目前血液凈化的不足。本課題組成功地應(yīng)用腎小管上皮細(xì)胞（RTCs）構(gòu)建了RAD，并在國(guó)內(nèi)率先完成了RAD

2、的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。但我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，符合臨床實(shí)際ARF合并MODS大動(dòng)物模型的建立、細(xì)胞的來(lái)源與壽命等問(wèn)題是RAD基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的瓶頸。因此，本研究創(chuàng)建缺血性ARF伴嚴(yán)重感染后MODS豬模型，探討ARF合并MODS與免疫失衡的關(guān)系;同時(shí)利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與RTCs共培養(yǎng)來(lái)優(yōu)化RAD，為RAD提供最適細(xì)胞來(lái)源;用優(yōu)化構(gòu)建的RAD對(duì)ARF合并MODS豬模型進(jìn)行治療，觀察其療效并探討其機(jī)制。
　　第一部分 急性腎衰竭合并多

3、器官功能障礙模型建立及其免疫功能研究
　　目的:建立ARF伴MODS的豬模型，并探討ARF伴或不伴MODS動(dòng)物血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)和炎性細(xì)胞因子水平是否有顯著差異，分析ARF合并MODS發(fā)生發(fā)展的免疫機(jī)制。
　　方法:22只健康雜交豬，隨機(jī)分為三組。CLP+CRA組(n=12):接受盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)造成腹腔感染致MODS，并夾閉腎動(dòng)脈(CRA)致缺血性ARF;CLP組(n=5):僅行CLP術(shù);C

4、RA組(n=5):僅行CRA術(shù)。觀察其生命體征和主要臟器功能。ELISA方法測(cè)定手術(shù)后不同時(shí)間（0、4、8、16、24和48小時(shí)）血清NGAL、TNF-α和IL-6的水平。
　　結(jié)果:(1)動(dòng)物在CLP+CRA術(shù)后24～72小時(shí)陸續(xù)出現(xiàn):ARF（血肌酐、尿素氮和鉀顯著升高），肝功能不全（ALT和AST顯著增加），平均動(dòng)脈壓下降，肺功能異常，腎、肝、肺和小腸組織出現(xiàn)明顯的病理變化。(2)CLP+CRA組、CLP組血清TNF-α濃度8

5、h時(shí)達(dá)到高峰，顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的CRA組(621.50±207.31pg/ml、597.18±211.57pg/ml vs194.82±57.06pg/ml, P＜0.01); CLP+CRA組、CLP組IL-6水平24h時(shí)顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的CRA組(P＜0.01)。CLP+CRA組、CRA組血清NGAL濃度在8h時(shí)明顯高于同時(shí)間點(diǎn)的CLP組(463.08±75.29ng/ml、317.42±58.51ng/mlvs132.67±43.

6、58ng/ml, P＜0.05)。
　　結(jié)論:盲腸結(jié)扎和穿孔造成嚴(yán)重腹腔感染致多器官功能障礙，加夾閉腎動(dòng)脈致腎缺血再灌注性ARF，證明按本法制作ARF合并MODS模型成功、穩(wěn)定。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其TNF-α、IL-6和NGAL水平，可預(yù)測(cè)和評(píng)估ARF合并MODS的發(fā)生情況和嚴(yán)重程度。
　　第二部分 生物人工腎中細(xì)胞的優(yōu)化及丹參酮對(duì)其影響
　　目的:建立人RTCs與骨髓MSCs體外最適共培養(yǎng)體系，為RAD的構(gòu)建提供理想細(xì)胞來(lái)源，

7、并進(jìn)行共培養(yǎng)的機(jī)制研究;同時(shí)，觀察丹參酮對(duì)共培養(yǎng)體系的影響。
　　方法:(1)將人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)和人骨髓MSCs分別按照1∶1、3∶1、6∶1和10∶1等不同比例共培養(yǎng)。觀察各組HK-2細(xì)胞形態(tài)和功能變化;檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞色素P450活性和細(xì)胞活力;激光共聚焦監(jiān)測(cè)巨蛋白(megalin)表達(dá)情況。(2)在HK-2和MSCs最適比例的共培養(yǎng)體系中加入丹參酮ⅡA磺酸鈉溶液(含100umo l/L丹參酮ⅡA)，設(shè)為丹

8、參酮組;觀察丹參酮ⅡA對(duì)共培養(yǎng)體系的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)與分析HK-2細(xì)胞周期變化、凋亡情況(AnnexinⅤ-FITC/PI法);CCK8測(cè)定HK-2細(xì)胞增殖;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的水平。
　　結(jié)果:(1)通過(guò)顯微鏡觀察，HK-2/MSCs3∶1共培養(yǎng)組為各組中HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)最佳;該組HK-2細(xì)胞存活率、細(xì)胞色素P450、細(xì)胞活力和megalin表

9、達(dá)量均顯著高于其余比例組（P均＜0.05）。(2)細(xì)胞培養(yǎng)24h時(shí)，共培養(yǎng)組(HK-2/MSCs=3∶1)、丹參酮組HK-2細(xì)胞G0-G1期比例較單純HK-2培養(yǎng)組（HK-2組）明顯減少，G2-S期比例則顯著增多(P＜0.05);共培養(yǎng)組、丹參酮組培養(yǎng)24h、48h、72h細(xì)胞調(diào)亡率均明顯低于HK-2組（24h:1.74±0.03％、1.68±0.01％ vs2.75±0.02％，P＜0.05）;共培養(yǎng)組、丹參酮組HK-2在24h、48

10、h細(xì)胞增殖能力均高于HK-2組(P＜0.05);共培養(yǎng)組、丹參酮組在24h、48h時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IGF-1和BMP-7水平均高于HK-2組(P＜0.05);但上述指標(biāo)在共培養(yǎng)組與丹參酮組之間均未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:HK-2與人骨髓MSCs體外共培養(yǎng)可維持HK-2形態(tài)與功能，HK-2與MSCs按3∶1比例共培養(yǎng)可最大程度維持HK-2功能，為構(gòu)建功能性RAD提供了高效細(xì)胞材料。最適共培養(yǎng)體系中加入丹參酮ⅡA并

11、未明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡及改善其功能。
　　第三部分 改良生物人工腎治療多器官功能障礙豬模型的作用及機(jī)制
　　目的:觀察骨髓MSCs與HK-2共培養(yǎng)構(gòu)建的RAD治療ARF合并MODS豬的效果，探討其作用機(jī)制。
　　方法:ARF并MODS豬隨機(jī)分為四組:①常規(guī)RAD治療組（A組，n=5），將單純HK-2培養(yǎng)構(gòu)建的RAD與血濾器連接，行RAD串聯(lián)CVVH治療24小時(shí);②共培養(yǎng)RAD治療組（B組，n=5），RAD中細(xì)

12、胞為共培養(yǎng)后HK-2，余同A組;③假RAD治療組（C組，n=5），將RAD換為無(wú)細(xì)胞的假RAD，余同A組;④未血液凈化治療組（D組，n=6）。觀察和記錄生命體征、生化指標(biāo)（包括血肌酐、尿素氮、電解質(zhì)）、血?dú)夥治?、?xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和生存時(shí)間。
　　結(jié)果:四組動(dòng)物治療前MAP無(wú)顯著性差異，均值為79.13±12.06mmHg;A、B兩組治療4h后血壓逐漸回升，24h時(shí)B組MAP（101.20±9.37mmHg）

13、，顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的A組（93.42±7.35mmHg）、C組（64.75±9.61mmHg）和D組（54.29±3.01mmHg）（P＜0.05）。四組CVVH前SCr無(wú)明顯差異;治療24hA、B組SCr水平明顯低于C、D組(P＜0.05)，而A、B組之間無(wú)顯著性差異。B組IL-10的峰值(301.72±46.35pg/ml)，明顯高于A組（261.33±51.72pg/ml）、C組（130.47±14.97pg/ml）、D組(104

14、.11±10.89pg/ml)(P＜0.05)。各組治療開(kāi)始前血TNF-α水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均值為519.33±42.16pg/ml;A、B兩組治療開(kāi)始后血TNF-α水平逐漸下降，24h時(shí)均值分別為413.65±33.91pg/ml、329.51±27.64pg/ml，兩組有顯著性差異(P＜0.05)。A、B、C三組治療前后血清IL-6水平無(wú)明顯改變，但D組血清IL-6濃度進(jìn)行性升高。B組的平均生存時(shí)間為124.38±17.09h，明顯