腺病毒介導(dǎo)的PTEN基因在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過研究腺病毒介導(dǎo)的PTEN基因在體外培養(yǎng)的皮膚 T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株 Hut78細(xì)胞中有無抑制其增殖及促進(jìn)其凋亡的作用及其作用機(jī)制，以進(jìn)一步探討皮膚 T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制及 PTEN基因在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用機(jī)制，為開發(fā)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的新的治療方法提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.研究對象：人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Hut78購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。人胚腎細(xì)胞株 HEK293細(xì)胞由河北

2、省四院腫瘤研究所保存，攜帶PTEN基因的腺病毒adenovirus-pten(ad-pten)及空白對照攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒空載體adenovirus-gfp(ad-gfp)質(zhì)粒均購于加拿大Abm公司。
　　2.細(xì)胞的培養(yǎng)：人皮膚 T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株 Hut78細(xì)胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，48-72h傳代1次，HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，24-48h傳代1次，置于3

3、7℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
　　3.腺病毒的制備：攜帶PTEN、GFP基因的腺病毒質(zhì)粒ad-pten、ad-gfp轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒的擴(kuò)增、純化、滴度測定。
　　4.腺病毒感染率的分析：熒光顯微鏡下觀察攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒ad-GFP感染Hut78細(xì)胞的效率。將對數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞配成濃度為2×106/ml的單細(xì)胞懸液接種于六孔板（1ml/孔），以不同感染復(fù)數(shù)

4、（MOI=1、10、50）的ad-GFP腺病毒感染細(xì)胞，培養(yǎng)24h、48h后分別于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。
　　5.感染腺病毒后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：光學(xué)顯微鏡下觀察重組腺病毒ad-PTEN和 ad-GFP分別以感染復(fù)數(shù) MOI=1、10、50感染 Hut78細(xì)胞24h、48h后，細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)變化。
　　6.感染腺病毒后細(xì)胞增殖抑制情況分析：CCK-8法測定不同感染復(fù)數(shù)、不同感染時間的腺病毒ad-PTEN,

5、ad-GFP對Hut78細(xì)胞株增殖的抑制率。將對數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞配成濃度為2×102/μl的單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔50μl，ad-PTEN, ad-GFP腺病毒以感染復(fù)數(shù) MOI=1、10、50感染細(xì)胞，每孔50μl，并設(shè)空白孔（不含細(xì)胞的培基）和對照孔（未做感染的細(xì)胞），感染24、48h后，每孔加入10μl CCK-8，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1-4h，酶標(biāo)儀測吸光度值（OD值），計(jì)算相應(yīng)的增殖抑制率，并進(jìn)

6、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。
　　7.感染腺病毒后細(xì)胞凋亡情況分析：流式細(xì)胞術(shù)法測細(xì)胞凋亡率。將對數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞配成濃度為5×106/ml的單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔1ml，設(shè)空白對照組及 ad-PTEN(MOI=1、10)感染組，感染24h后行流式細(xì)胞術(shù)。
　　8.PTEN及下游信號通路蛋白的表達(dá)：Western Blot法檢測PTEN蛋白及其下游信號通路蛋白PI3k, Akt, Caspas

7、e-3的表達(dá)情況。將對數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞以5×106/ml的濃度接種于6孔板中，每孔1ml，以不同感染復(fù)數(shù)(MOI=1、10、50)的ad-PTEN感染細(xì)胞，并設(shè)對照孔（未做感染的細(xì)胞孔），培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞的總蛋白，行Western Blot。
　　結(jié)果：
　　1.腺病毒制備結(jié)果：經(jīng)過病毒的擴(kuò)增，純化，滴度測定，最終收獲的病毒滴度均是1×109pfu/ml;
　　2.腺病毒的感染效率：熒光顯微鏡下觀察重組腺病

8、毒ad-GFP在Hut78細(xì)胞中的感染效率結(jié)果示感染效率隨感染復(fù)數(shù)的增高及感染時間的延長而增高，感染效率50(MOI)>10(MOI)>1(MOI),48h>24h;
　　3.感染腺病毒后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化：光學(xué)顯微鏡下觀察重組腺病毒ad-PTEN感染組的Hut78細(xì)胞隨著感染復(fù)數(shù)增高及感染時間的延長，細(xì)胞內(nèi)空泡、顆粒物的數(shù)量增多，部分細(xì)胞的核固縮、折光性變差，胞膜碎裂，細(xì)胞發(fā)生凋亡、死亡。而空白對照組及ad-GFP感染組細(xì)胞生長狀

9、態(tài)及形態(tài)未發(fā)生明顯變化;
　　4.感染腺病毒后細(xì)胞增殖受抑制情況：導(dǎo)入 PTEN基因后的Hut78細(xì)胞增殖受到抑制，抑制率隨感染復(fù)數(shù)的增高及感染時間的延長而增高。均感染24h后 ad-PTEN組（MOI=0、1、10、50）組抑制率分別為0，(35.87±12.95)%，（58.53±16.71）%，（73.04±5.07）%，P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組內(nèi)比較除MOI=10組與MOI=50組之間P值>0.05，差異沒有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義之外，其余各組內(nèi) P值均小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ad-GFP組（MOI=0、1、10、50）的抑制率分別為0、（4.83±0.84）%、（16.93±4.35）%、（21.87±5.72）%，P=0.39，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各組內(nèi)相互比較 P值均大于0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。感染48h后ad-PTEN組（MOI=0、1、10、50）的增殖抑制率分別為0、（46.43±12.63）%、（64.28±13.40）%

11、、（91.96±3.76）%，P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組內(nèi)相互比較除 MOI=1與 MOI=50組間 P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ad-GFP組（MOI=0、1、10、50）的抑制率分別為0、（18.98±5.28）%、（22.11±8.39）%、（20.31±1.56）%，P=0.20，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各組內(nèi)P值均大于0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　5.感染腺病毒后細(xì)胞的凋

12、亡情況：在空白對照組、重組腺病毒ad-PTEN感染組（MOI=1、10），Hut78早期凋亡率分別為6.5%、12.8%、18.2%，隨著感染復(fù)數(shù)的增高，細(xì)胞早期凋亡逐漸增多;
　　6.PTEN及下游信號通路蛋白的表達(dá)：在空白對照組、重組腺病毒ad-PTEN（MOI=1、10、50）組 PI3k、Akt蛋白表達(dá)逐漸減弱，在空白對照組、MOI=1、10組 PTEN蛋白、Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)， MOI=50組二者表達(dá)

13、均較MOI=10組有所減弱。
　　結(jié)論：
　　1.皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株可被腺病毒感染且感染效率隨腺病毒感染復(fù)數(shù)的增加及感染時間的延長而增加。
　　2.腺病毒導(dǎo)入的PTEN基因產(chǎn)生正常的PTEN蛋白使皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。
　　3.腺病毒導(dǎo)入的PTEN基因產(chǎn)生的正常PTEN蛋白抑制了皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長增殖能力。
　　4.腺病毒導(dǎo)入的PTEN基因產(chǎn)生的正常PTEN蛋