鴨肝堿性磷酸酶的分離純化、部分性質(zhì)及固定化研究.pdf

1、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，簡稱ALP，EC3.1.3.1)廣泛存在于微生物和動(dòng)物界，在堿性條件下能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在生物體內(nèi)的磷代謝過程中起著十分重要的作用，也是家鴨重要的代謝酶之一，與家鴨的生長發(fā)育密切相關(guān)。 以鴨肝為材料，經(jīng)過勻漿、正丁醇除脂、硫酸銨分級分離、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱

2、層析、Sephacryl S-200凝膠過濾等步驟，分離純化出電泳純的堿性磷酸酶，該酶純化倍數(shù)達(dá)58.3倍，比活為337.4U/mg。經(jīng)凝膠過濾和SDS-PAGE測得該酶的全分子量為121. 0kD，亞基分子量為60.5kD。以磷酸苯二鈉為底物，測得該酶的最適pH為9.0，最適溫度為40℃。Na+、K+、Li+等一價(jià)離子對該酶活性基本無影響,Mg2+、Mn2+對該酶活性有激活作用，Cd2+對該酶活性有抑制作用。米氏常數(shù)Km為1.28mm

3、ol/L。 在一定條件下分別采用苯甲基磺酰氟(PMSF)，N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、二巰基蘇糖醇(DTT)、對氯汞苯甲酸(PCMB)、琥珀酸酐(SWAN)、溴乙酸(BrAc)、碘乙酸(IAc)、甲醛、乙酰丙酮(BD)、氯胺-T等化學(xué)修飾劑選擇修飾鴨肝堿性磷酸酶的多種氨基酸殘基，并測定其酶活力變化。結(jié)果表明，N-溴代琥珀酰亞胺、二巰基蘇糖醇的修飾能顯著抑制酶的活力，活力的降低與修飾劑的濃度有關(guān)。甲醛、氯胺-T也能抑制酶活力，但

4、是不明顯。苯甲基磺酰氟、對氯汞苯甲酸、溴乙酸、碘乙酸、乙酰丙酮的修飾對酶的抑制作用影響較小。因此認(rèn)為Trp，Lys殘基是鴨肝堿性磷酸酶的必需功能基團(tuán)，部分二硫鍵對保護(hù)酶的催化功能也是必需的。 選擇聚乙烯醇、海藻酸鈉聚合物為載體，采用包埋法固定化堿性磷酸酶，通過單因素試驗(yàn)觀察了海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、給酶量、固定化時(shí)間、固定化溫度對酶活回收率的影響；并通過正交實(shí)驗(yàn)對其固定化條件進(jìn)行優(yōu)化篩選。通過游離酶、固定化酶性質(zhì)的比較，研究了

5、固定化酶的部分酶學(xué)性質(zhì)，包括最適pH值、最適溫度、重復(fù)使用穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性等方面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：四個(gè)因素中聚乙烯醇濃度(A)對酶活力回收率具有較大影響，載體與酶的比例(C)對結(jié)果影響次之，氯化鈣濃度(B)，固定化時(shí)間(D)對結(jié)果影響均不明顯。 制備固定化鴨肝ALP的最佳條件為聚乙烯醇濃度為15％，CaCl2溶液濃度為2.5％，載體與酶的比例為1：1，固定化時(shí)間為1小時(shí)。固定化酶的最適反應(yīng)pH值為10.5，最適反應(yīng)溫度為45℃，