自發(fā)性動(dòng)脈壓力感受性反射功能缺陷模型大鼠的培育、表型及其缺陷的機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈壓力感受性反射(ABR)可以緩沖血壓的升高和降低，是心血管活動(dòng)最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一。ABR功能可以被量化，用壓力感受性反射敏感性（ BRS）表示。BRS被認(rèn)為是自主神經(jīng)系統(tǒng)的標(biāo)志。多中心臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論有無(wú)心血管疾病，BRS都是高血壓、腦卒中、心律失常、心力衰竭及心肌梗死等疾病死亡率的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子。
　　我們推測(cè)培育成功的自發(fā)性ABR缺陷動(dòng)物，也會(huì)在許多心血管疾病方面表現(xiàn)出高風(fēng)險(xiǎn)性。基于這一模型，可以進(jìn)一步明確ABR缺陷的

2、中樞分子靶標(biāo)。
　　我們利用55只雄性和61只雌性SD大鼠篩選ABR功能正常和低下的大鼠。清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下BRS和血壓的測(cè)量結(jié)果顯示，雄性大鼠的平均BRS和收縮壓(SBP)分別為0.77 ms/mmHg和130 mmHg。雌雄之間沒(méi)有差異。根據(jù)BRS的分布，我們將BRS＜0.6 ms/mmHg的大鼠定義為動(dòng)脈壓力感受性反射功能缺陷的大鼠(ABR-DRs)，將BRS＞0.8ms/mmHg的大鼠定義為動(dòng)脈壓力感受性反射功能正常的大鼠

3、(ABR-NRs)。由于高血壓會(huì)影響B(tài)RS和交感活化，在培育過(guò)程中我們只選擇血壓正常的大鼠進(jìn)行培育和繁殖。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，我們選擇了20只（♂∶♀=1∶1）BRS低的大鼠作為ABR-DRs的原代，20只（♂∶♀=1∶1）BRS高的大鼠作為ABR-NRs的原代。每一株大鼠原代，均采取隨機(jī)配對(duì)的方法進(jìn)行交配，得到第一代ABR-DRs，及其對(duì)照ABR-NRs。隨后代數(shù)的大鼠采取“先近親繁殖后篩選”的方式進(jìn)行培育，即先兄妹近親繁殖，待幼鼠離乳后，

4、再對(duì)其父本進(jìn)行清醒動(dòng)物血壓和BRS的測(cè)量。只有兩個(gè)指標(biāo)均符合上述篩選的標(biāo)準(zhǔn)，其子代才予以保留;否則，子代被淘汰。我們只篩選鑒定雄性動(dòng)物，以減輕工作負(fù)擔(dān)。
　　經(jīng)過(guò)20代的選擇性培育，兩株動(dòng)物BRS差異顯著(ABR-NRs vs ABR-DRs，1.20±0.26 ms/mmHg vs0.46±0.12 ms/mmHg，P＜0.01）。在培育過(guò)程中，盡管所有高血壓大鼠的子代均已被淘汰，ABR-DRs的血壓依然高于ABR-NRs。從第

5、9代起，ABR-DRs的SBP和DBP比ABR-NRs均高約10 mmHg。除了個(gè)別代數(shù)，兩株大鼠的心率(HR)并不存在差異。
　　同時(shí)，我們對(duì)第19、20代的雌性大鼠也進(jìn)行了血壓和BRS的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)雌雄間各個(gè)指標(biāo)趨勢(shì)相同。因此，在隨后的研究中，我們只選用雄性大鼠。
　　我們?cè)诓煌挲g段（1、2、4、6、8月齡）測(cè)量了兩株模型動(dòng)物的BRS，以檢查年齡是否影響兩株大鼠間的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從1月齡起，ABR-DRs的BRS就顯著

6、低于ABR-NRs（0.25±0.08 ms/mmHg vs0.72±0.25 ms/mmHg，n=7，P＜0.01）。隨著月齡的增加，兩株大鼠的BRS總體均呈增加趨勢(shì)。到8月齡時(shí)，ABR-NRs的BRS高達(dá)1.19 ms/mmHg，ABR-DRs則只增加到0.45 ms/mmHg(P＜0.01)。
　　在接下來(lái)的研究中，我們開(kāi)始驗(yàn)證我們的工作假設(shè):心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)性隨著B(niǎo)RS的分離而明顯不同。
　　我們通過(guò)股動(dòng)、靜脈插管的

7、方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了不同月齡（1、2、4、6、8月齡）兩株大鼠的SBP、DBP和心率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1月齡時(shí)，ABR-DRs的SBP和DBP就都顯著高于ABR-NRs約10 mmHg，心率顯著快于ABR-NRs;隨著月齡的增加，兩株大鼠的血壓持續(xù)性緩慢增加，差異依然存在，但心率不再有差異。我們也用尾動(dòng)脈測(cè)壓的方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了不同月齡時(shí)的上述指標(biāo)，得到了相似的結(jié)果。更為重要的是，ABR-DRs的高血壓發(fā)生率顯著高于ABR-NRs。在第10代時(shí)，AB

8、R-NRs的高血壓發(fā)生率為10.7％(n=28)，而ABR-DRs則為38.9％（n=36，P＜0.05）。在第19代，差異更為顯著（ABR-NRs，0％，n=28; ABR-DRs，57.8％，n=38; P＜0.01）。這些結(jié)果表明ABR-DRs的高血壓風(fēng)險(xiǎn)性增加。
　　在2月齡時(shí)，我們檢測(cè)了兩株模型大鼠血清中血糖、血脂、肝腎功能相關(guān)代謝指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)ABR-DRs的隨機(jī)血糖、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白

9、和瘦素均顯著高于ABR-NRs，表明ABR-DRs出現(xiàn)了血糖、血脂代謝異常。而空腹胰島素及肝腎功能相關(guān)指標(biāo)沒(méi)有差異。
　　我們還檢測(cè)了8月齡大鼠的糖代謝相關(guān)指標(biāo)。與ABR-NRs相比，ABR-DRs的隨機(jī)血糖、空腹血糖和糖化血紅蛋白顯著升高。但是，二者的空腹胰島素水平并沒(méi)有顯著的差異。同時(shí)，ABR-DRs的糖耐量和胰島素耐量受損，但胰島素的分泌沒(méi)有問(wèn)題，很可能是機(jī)體對(duì)胰島素產(chǎn)生了抵抗。因此，ABR-DRs存在代謝異常。
　　

10、我們觀察記錄了第20代ABR-NRs和ABR-DRs在1-25月齡期間的體重和進(jìn)食量。在1月齡和2月齡時(shí)，ABR-DRs的進(jìn)食量顯著高于ABR-NRs，但二者體重沒(méi)有差異。隨后在3-8月齡（6月齡除外）期間，兩株大鼠的進(jìn)食量相同;從9月齡開(kāi)始，ABR-DRs的進(jìn)食量顯著低于ABR-NRs。從7月齡開(kāi)始，ABR-DRs的體重持續(xù)顯著高于ABR-NRs。這兩個(gè)指標(biāo)的差異一直持續(xù)到24月齡。在10月齡時(shí)，我們對(duì)兩株大鼠進(jìn)行了脂肪分布的測(cè)量。與

11、ABR-NRs相比，ABR-DRs的體重增加了96 g，總脂肪重量增加約45 g，其皮下、附睪、腸系膜、腎周及腹膜后、肩胛骨、胃周和主動(dòng)脈周?chē)闹局亓亢捅壤@著增加。這些結(jié)果表明，ABR-DRs存在超重問(wèn)題。
　　與ABR-NRs相比，ABR-DRs在舒張期和收縮期的左心室內(nèi)徑、左心室體積及射血體積、射血分?jǐn)?shù)、心輸出量均沒(méi)有顯著性差異，表明其并不存在心功能受損;但它們?cè)谑鎻埰诤褪湛s期的左心室前壁厚度、收縮期的左心室后壁厚度顯著

12、增加，這表明ABR-DRs存在心肌肥厚。通過(guò)稱重，我們發(fā)現(xiàn)，與ABR-NRs相比，ABR-DRs的心臟、左心室和右心室的重量顯著增加，進(jìn)一步說(shuō)明其存在心肌肥厚;ABR-DRs單位厘米的主動(dòng)脈重量也顯著增加;二者右腎的重量并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2月齡大鼠的急性心肌缺血結(jié)果顯示，ABR-DRs左心室缺血組織重量和面積增加，說(shuō)明其缺血損傷加重。在阻斷大腦中動(dòng)脈造成缺血性腦卒中模型中，ABR-DRs的缺血面積和比例顯著增加，神經(jīng)缺陷評(píng)分

13、也明顯增加。這些結(jié)果表明ABR-DRs急性心肌梗死和腦缺血的損傷加重。
　　1-16月齡時(shí)的負(fù)重強(qiáng)迫游泳結(jié)果顯示，ABR-DRs在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的游泳時(shí)間均短于ABR-NRs;并且隨著年齡的增加，兩株大鼠的游泳時(shí)間逐漸降低。跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示ABR-DRs跑步至力竭的時(shí)間顯著短于ABR-NRs。這些結(jié)果說(shuō)明，ABR-DRs的有氧運(yùn)動(dòng)能力低下。
　　我們也記錄了ABR-NRs和ABR-DRs的生存時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABR-DRs的

14、壽命顯著縮短。
　　以該動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，我們展開(kāi)了ABR功能缺陷的機(jī)制研究。我們通過(guò)記錄腎交感神經(jīng)活動(dòng)(RSNA)來(lái)檢測(cè)ABR-DRs的交感神經(jīng)是否存在過(guò)度活化。基礎(chǔ)狀態(tài)下，ABR-DRs的RSNA與ABR-NRs并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然后，我們通過(guò)靜脈給予一定量的去氧腎上腺素來(lái)升高血壓(約50 mmHg)，激活壓力反射，以觀察ABR對(duì)交感神經(jīng)活化的調(diào)控。結(jié)果表明，ABR-DRs的RSNA變化率與ABR-NRs相比并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這

15、些結(jié)果表明ABR-DRs壓力反射的交感支并沒(méi)有異常。與ABR-NRs相比，升壓后ABR-DRs的心率降低幅度顯著減小。而心率主要是由迷走神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的，因此上述結(jié)果表明ABR-DRs的副交感功能受損。
　　迷走神經(jīng)的中樞是疑核。疑核節(jié)前心迷走神經(jīng)元(CVPNs)決定了心臟的緊張性和反射性調(diào)控，其自發(fā)性電活動(dòng)的強(qiáng)弱與疑核副交感功能密切相關(guān)。我們利用逆向熒光染料(XRITC，Invitrogen)標(biāo)記CVPNs，然后進(jìn)行電生理膜片鉗實(shí)

16、驗(yàn)。與ABR-NRs相比，ABR-DRs疑核CVPNs的自發(fā)性放電頻率頻率顯著降低。加入外源性谷氨酸，可興奮CVPNs，增加自發(fā)性放電的頻率，但ABR-DRs增加的百分比顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，ABR-DRs的疑核CVPNs的電活動(dòng)異常。
　　谷氨酸能和γ-氨基丁酸能突觸傳遞通路是疑核CVPNs的主要突觸傳入。我們同時(shí)阻斷NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸）受體、AMPA（α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸）受體和GABA

17、A(γ-氨基丁酸)受體，ABR-NRs和ABR-DRs CVPNs自發(fā)性放電的差異被取消。但是單獨(dú)阻斷GABAA受體并不影響兩組大鼠CVPNs自發(fā)性放電之間的差異。因此，ABR-DRs疑核CVPNs的自發(fā)性放電頻率降低主要是由谷氨酸能突觸通路影響的。
　　AMPA受體阻斷劑預(yù)處理可以取消兩株模型大鼠CVPNs自發(fā)性放電頻率的差異，并且完全取消了谷氨酸對(duì)CVPNs的興奮作用。NMDA阻斷劑并不能取消兩株大鼠間的放電差異，也不影響谷氨

18、酸對(duì)CVPNs的興奮作用，并且ABR-DRs放電頻率增加的百分比依然顯著低于ABR-NRs。因此，AMPA受體參與了ABR-DRs疑核CVPNs的電活動(dòng)異常。
　　本課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心血管疾病的危險(xiǎn)因素確實(shí)隨著B(niǎo)RS的分離而明顯不同。ABR-DRs在許多心血管疾病方面表現(xiàn)出高風(fēng)險(xiǎn)性，如高血壓、高血糖、高血脂、超重及有氧運(yùn)動(dòng)能力低下。BRS受損導(dǎo)致迷走神經(jīng)傳出減弱，是心血管疾病的危險(xiǎn)因素，也會(huì)顯著縮短生存時(shí)間。疑核心迷走神經(jīng)元自