超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）CTX-M-69基因的克隆表達、鑒定及酶學性質初步研究.pdf

1、本研究根據Genbank中CTX-M-1組超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的基因序列為目的基因，設計并合成了特異性引物，采用PCR技術，以產CTX-M型ESBLs菌株的質粒為模板，擴增出CTX-M型ESBLs全基因，將全基因序列克隆到PGM-T載體上并測序，測序結果表明其開放閱讀框有876個堿基，編碼291個氨基酸。將序列結果送交國際B-內酰胺酶認證機構(http://www.lahey.org/Studies)，證實本研究擴增的序列是

2、一種新型的CTX-M型ESBLs基因，命名為CTX-M-69(GenBank登錄號：EU402393)，蛋白質序列編號為ABY91281.1。將CTX-M-69核苷酸序列及推導氨基酸序列與國內外其它CTX-M型ESBLs進行同源性比較，結果顯示，CTX-M-69序列與CTX-M-1(GenBank登錄號：X92506)的核苷酸同源性為98％(867/877)，與CTX-M-1編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號：CAA63262.1)

3、同源性為98％(287/291)，確定CTX-M-69基因屬于CTX-M-1組。與CTX-M-1相比，有10個核苷酸位點發(fā)生突變，其中6個位點為無義突變，4個位點發(fā)生了氨基酸替換。同時，與GenBank上同一組的部分CTX-M型氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，同源性達到了98.9％以上。 采用PCR技術，以CTX-M-69基因克隆載體為模板，擴增出蛋白的編碼基因(876bp)，并將其插入pET-30b(+)表達質粒，構建了ESBLsCTX

4、-M-69重組表達質粒。重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達重組蛋白。SDS-PAGE結果表明表達出33kD左右的融合蛋白，可溶性檢測表明表達產物以可溶性形式(上清中)和包涵體形式(沉淀中)兩種形式存在。通過對表達條件的優(yōu)化，試驗確定ESBLsCTX-M-69蛋白表達的最佳條件為誘導物WrG0.4mmol/L，30℃誘導培養(yǎng)4h，在最佳表達條件下，重組蛋白表達含量有較明顯的提高。CTX-M-69基因工程菌對頭孢噻肟、

5、頭孢他啶、含克拉維酸的頭孢噻肟和頭胞他啶的藥物敏感性試驗，結果表明基因工程菌符合產超廣譜B-內酰胺酶的表型特征(NCLLs2006)，表明CTX-M-69基因工程菌產ESBLs。同時，重組蛋白對12種B-內酰胺類水解活性的測定表明抗菌譜與CYX-M-1組大致相當，最大的區(qū)別在于CTX-M-69型ESBLs對頭孢他啶的水解能力較弱。試驗測定結果表明CTX-M-69型ESBLs在pH為7.8～8.6，溫度為30℃時活性最大，底物濃度過大時酶