兒童生物樣本中揮發(fā)性生化物質的檢測及其應用.pdf

1、短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)，也稱作揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)，是人結腸細菌發(fā)酵的主要產物。包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸和庚酸。短鏈脂肪酸主要通過腸道菌群對大腸內的碳水化合物發(fā)酵和蛋白質降解產生，其含量變化能夠直觀的反映出人體內腸道菌群的狀況。已經有研究表明，腸道生態(tài)紊亂可能是孤獨癥的發(fā)病原因之一，大多數孤獨癥患者的腸道菌群與正常人的相

2、比是有顯著不同的，而這些有差異的腸道菌群能發(fā)酵大腸內未消化的食物從而產生一些生物活性物質如短鏈脂肪酸，這個發(fā)酵過程產生的如酚類、胺類等一些副產物，會對人的身體特別是腦部的神經發(fā)育造成較為嚴重的損害。
　　本研究包括以下四個方面:(1)面向生物樣本中短鏈脂肪酸吸附萃取的納米纖維篩選優(yōu)化;(2)基于納米纖維固相萃取前處理的短鏈脂肪酸檢測方法的建立;(3)孤獨癥兒童和正常兒童尿液樣本中短鏈脂肪酸的檢測及數據分析;(4)肥胖兒童和正常兒童

3、尿液樣本中短鏈脂肪酸的檢測及數據分析。
　　論文主要工作如下:
　　一、面向生物樣本中短鏈脂肪酸吸附萃取的納米纖維篩選優(yōu)化
　　由于短鏈脂肪酸易揮發(fā)、極性高、親水性強，同時血漿、唾液、尿液和糞便等含有短鏈脂肪酸的生物樣品，基質非常復雜并且短鏈脂肪酸在血漿、唾液、尿液和糞便中的含量均較低，直接分析這些化合物難度大，現有的提取純化方法有高速離心法、超濾法、萃取法包招液-液萃取、液-固萃取、固相微萃取(SPME)、超臨界萃取

4、(SFE)、液相微萃取(LPME)等。經這些方法提取純化后能滿足一定的測定要求，但這些提取純化方法依然有不足之處。為了篩選最適合吸附萃取SCFAs的納米纖維，本文以多種SCFAs為目標物考察不同納米纖維對短鏈脂肪酸的吸附萃取性能。將納米纖維裝填成固相萃取小柱，配制適當濃度的SCFAs水溶液，將其過柱吸附萃取，待SCFAs富集在納米纖維上后，利用溶劑解析的方法將富集的SCFAs從納米纖維上解析下來，洗脫液用氣相色譜儀分析。本文考察了不同納

5、米纖維對SCFAs的吸附能力，同時對萃取材料的選取、不同洗脫劑的選擇、萃取方式的確定、洗脫劑pH值的確定、洗脫劑加酸種類的確定等方面做了優(yōu)化，并與SPME萃取效率進行對比研究。與現有方法相比，新建立的基于纖維萃取的方法操作簡便、快捷、有效。
　　二、基于納米纖維固相萃取前處理的短鏈脂肪酸檢測方法的建立
　　本文利用篩選出的對揮發(fā)性目標物較好的吸附特性納米纖維，建立了基于纖維前處理聯合氣相色譜以及氣相色譜-質譜檢測SCFAs的

6、方法，并對方法進行驗證。以人工尿液配制的SCFAs為樣品，對適宜的SCFAs濃度水平，方法的回收率為82.6％-110.5％，日內和日間精密度分別為1.4％-9.6％和1.1％-4.4％，最低檢測限(Limit of detection，LOD)為0.25-2.67ng/mL，最低定量限(Limit of quantification，LOQ)為0.85-8.97ng/mL，沒有明顯的基質效應。結果表明基于納米纖維的富集檢測SCFAs的

7、方法準確可靠，為實際樣本中SCFAs的富集檢測提供了簡單、準確的新技術和新方法。
　　三、孤獨癥兒童和正常對照組兒童尿液樣本中短鏈脂肪酸的檢測及數據分析
　　本文招募孤獨癥兒童和正常對照組兒童各10名，收集這些兒童的晨尿樣本，利用建立好的固相萃取新方法對孤獨癥兒童和正常對照組兒童的尿液樣本中的SCFAs進行前處理，溶劑洗脫后利用氣相色譜-質譜聯用儀進行檢測。檢測結果使用SPSS18.0對所得數據進行分析，結果發(fā)現孤獨癥組兒童

8、尿液中的SCFAs含量均顯著高于正常對照組兒童。
　　四、肥胖兒童和正常對照組兒童尿液樣本中短鏈脂肪酸的檢測及數據分析
　　本文招募肥胖兒童和正常對照組兒童各23名，收集這些兒童的尿液樣本，利用建立好的固相萃取新方法對孤獨癥兒童和正常對照組兒童的尿液樣本中的SCFAs進行前處理，溶劑洗脫后利用氣相色譜-質譜聯用儀進行檢測。檢測結果使用SPSS18.0對所得數據進行分析，結果發(fā)現肥胖兒童尿液中丙酸、戊酸、異戊酸、己酸和庚酸的含