Smac類似物LCL161對結腸癌細胞株增殖與凋亡的影響及其機制的初步探討.pdf

1、目的：
　　1.觀察Smac類似物LCL161對結腸癌細胞株增殖的影響。
　　2.研究LCL161是否通過誘導結腸癌細胞凋亡發(fā)揮對其增殖的影響。
　　3.探討LCL161誘導凋亡的可能機制。
　　方法：
　　1. MTT法檢測LCL161對結腸癌細胞SW480及HT-29存活率的影響。
　　2.克隆形成實驗檢測LCL161對結腸癌細胞克隆形成的影響。
　　3. JC-1染色法檢測LCL161對結

2、腸癌SW480及HT-29細胞內(nèi)ATP水平的影響。
　　4. DAPI染色法檢測LCL161對人結腸癌SW480及HT-29細胞株細胞核的影響。
　　5.溴化丙啶（propidium iodide，PI）單染法檢測LCL161對結腸SW480及HT-29細胞株凋亡的影響。
　　6.電鏡觀察LCL161處理結腸癌細胞后細胞亞顯微結構的變化。
　　7.Western blot法檢測LCL161處理人結腸癌SW480及

3、HT-29細胞株對IAPs（XIAP，cIAP1/2）及TNF-α表達的影響。
　　結果：
　　1 LCL161抑制人結腸癌SW480和HT-29細胞株的增殖
　　1.1MTT實驗結果顯示不同濃度LCL161(0,0.2,1,5,10?mol/L)對人結腸癌SW480及HT-29細胞株均抑制細胞存活率的作用，且隨著LCL161濃度的增加和作用時間的延長，對細胞存活率的抑制逐漸增強，高濃度LCL161抑制作用較明顯。在濃

4、度為10μmol/L時，觀察LCL161作用24 h時細胞存活率分別為44.6％，78.6%。
　　1.2克隆形成實驗顯示LCL161可以抑制人結腸癌SW480及HT-29細胞株的克隆增殖，且隨著LCL161濃度的增加，對克隆的抑制逐漸增強。
　　2 LCL161誘導人結腸癌SW480和HT-29細胞株的細胞凋亡
　　2.1 LCL161可以降低 JC-1在線粒體膜上的紅色熒光強度，提高其綠色熒光強度，說明LCL161

5、可以降低兩株細胞的線粒體膜電位。
　　2.2 DAPI染色實驗結果顯示，LCL161可導致兩株乳腺癌細胞內(nèi)的細胞核濃染，核分裂增多，并和LCL161濃度相關，表明LCL161可引起結腸癌細胞核固縮，分裂。
　　2.3不同濃度的LCL161（0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L）處理人結腸癌細胞SW480和HT-2924 h后，PI單染法檢測結果顯示：隨著LCL161濃度的增加，SW480和HT-29細胞的死亡率逐

6、漸增多，凋亡細胞比例分別為1.6%、30.1%、49.1%和5.8%、14.7%、26.1%。說明LCL161可以誘導結腸癌細胞凋亡。
　　2.4透射電鏡（TEM）觀察結腸癌細胞受LCL161刺激后的亞細胞顯微結構的改變。結果示：相比較空白對照組，實驗組（10??mol/L）的較多結腸癌細胞均出現(xiàn)細胞膜皺縮，染色質邊集，細胞核固縮及凋亡小體形成等典型凋亡形態(tài)學特征。
　　3 LCL161誘導cIAP1降解，促進TNF-α合成

7、，介導結腸癌細胞的凋亡
　　3.1 Western-blot法分別檢測LCL161處理后各組結腸癌SW480和HT-29兩種細胞株細胞凋亡抑制蛋白（cIAP1、cIAP2、XIAP）的表達水平。從實驗的結果可以觀察出：1.隨著藥物濃度的增加，cIAP1的蛋白的表達在兩個細胞株中都存在逐漸減少的趨勢。2.同樣的方法和時間點，但是觀察到cIAP2、XIAP的蛋白的表達變化不明顯。
　　3.2隨著LCL161濃度增高，兩株細胞內(nèi)的

8、TNF-α在PVDF膜上顯示出條帶逐漸濃深。說明LCL161可以促進外源性細胞凋亡通路配體TNF-α的表達。
　　結論：
　　1 Smac類似物LCL161能夠顯著地抑制人結腸癌SW480和HT-29細胞株的增殖能力，作為臨床治療結腸癌的新藥物具有一定的潛在研究價值。
　　2 Smac類似物LCL161引起的人結腸癌細胞的增殖抑制的可能機制是通過誘導結腸癌細胞發(fā)生細胞凋亡實現(xiàn)的。
　　3 Smac類似物LCL16