免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測流感病毒的研究.pdf

1、目的：
　　制備偶聯(lián)甲/乙型流感病毒單克隆抗體的免疫磁珠，利用免疫磁珠可以分離、富集、濃縮病原微生物的特征，并結(jié)合免疫層析技術(shù)，建立甲/乙型流感病毒的免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測方法。
　　方法：
　　1.通過膠體金標(biāo)記和免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法，初步建立快速檢測甲/乙型流感病毒的膠體金免疫層析方法，評價其靈敏度和特異性。
　　2.以納米磁珠代替膠體金作為標(biāo)記物的信號指示載體，采用雙抗體夾心檢測方法，以

2、EDC/NHS法制備偶聯(lián)了甲/乙型流感病毒抗體的免疫磁珠。
　　3.優(yōu)化免疫層析檢測系統(tǒng)，確定檢測線和質(zhì)控線的抗體最佳包被濃度和優(yōu)化緩沖液的表面活性劑。利用免疫磁珠結(jié)合免疫層析技術(shù)，初步建立磁珠免疫層析直接檢測方法，評價其靈敏度。
　　4.利用免疫磁珠將目標(biāo)抗原濃縮及富集分離的特性，優(yōu)化檢測條件，建立快速檢測甲/乙型流感病毒的免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測方法。
　　5.將梯度稀釋的甲/乙型病毒液，進行熒光定量PCR

3、(Real-Time PCR)檢測，檢測的CT值越低，病毒的起始濃度越高。根據(jù)熒光定量PCR檢測來評價磁珠免疫層析法、免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測法以及膠體金免疫層析法的靈敏度。
　　6.采用熒光定量PCR方法檢測甲/乙型流感作為標(biāo)準(zhǔn)，免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測法檢測80份臨床咽拭子樣本，同時與用傳統(tǒng)的膠體金檢測法進行比較，評估磁珠富集檢測與免疫層析一體化檢測方法的靈敏度、特異性及陽性符合率，并進行方法學(xué)評價。
　

4、　結(jié)果：
　　1.初步建立了甲/乙型流感病毒檢測的膠體金免疫層析法，其靈敏度較高，特異性較好。
　　2.優(yōu)化免疫層析系統(tǒng)，甲型流感病毒膠體金檢測試紙條檢測線抗體包被濃度為2mg/mL，質(zhì)控線抗體濃度為300ng/mL;乙型流感病毒膠體金檢測試紙條檢測線抗體包被濃度為4mg/mL，質(zhì)控線抗體濃度為300ng/mL，檢測效果最佳。納米磁珠免疫層析直接檢測方法可以檢出稀釋度為10-2的（相應(yīng)的熒光定量PCR檢測Ct值為20）甲型H

5、1N1流感病毒，可以檢出稀釋度為10-1的乙型流感病毒（相應(yīng)的熒光定量PCR檢測Ct值為23）。
　　3.通過磁珠將樣本富集、濃縮、分離后，建立的免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測法可以檢出甲型H1N1流感病毒稀釋度為10-3，乙型流感病毒稀釋度為10-2，說明本法與納米磁珠免疫層析直接檢測方法相比，靈敏度得到了明顯提高，并且檢測其他呼吸道病毒為陰性，說明特異性好。
　　4.納米磁珠免疫層析直接檢測方法與膠體金免疫層析檢測方法

6、在特異性、靈敏度上大致相同，均可以檢出熒光定量PCR檢測甲型H1N1流感病毒的Ct值≤22的咽拭子樣本，檢測乙型流感病毒的Ct值≤23的咽拭子樣本;但是免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測法可以檢出熒光定量PCR檢測甲型H1N1流感病毒Ct值≤28的咽拭子樣本，可以檢出乙型流感病毒的Ct值≤29的咽拭子樣本，說明免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測法的檢測靈敏度比上述兩種方法提高了一到兩個數(shù)量級。
　　5.免疫磁珠富集與免疫層析一體化檢測

7、法檢測臨床咽拭子樣本，以熒光定量PCR檢測方法作為標(biāo)準(zhǔn)，其陰性符合率（特異性）為100％，陽性符合率為70.8％，而膠體金法檢測陰性符合率（特異性）為100％，陽性符合率為47.9％，并且磁珠免疫層析法與膠體金法之間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　采用EDC/NHS方法制備了偶聯(lián)甲/乙型流感病毒單克隆抗體的免疫磁珠，探索研究了檢測甲/乙型流感病毒抗原的納米磁珠免疫層析直接檢測方法。利用磁珠的分離、富集特性