p53、線粒體基因多態(tài)性與二甲雙胍輔助卵巢癌化療增敏關(guān)系研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開論述：
　　第一部分：p53、線粒體DNA多態(tài)性與卵巢癌的關(guān)系。
　　目的：
　　通過對醫(yī)院臨床資料完整明確的河南地區(qū)非癌患者卵巢組織和上皮性卵巢癌病人癌變的卵巢組織中p53、D-loopDNA的突變和多態(tài)性進行比較，依據(jù)測序結(jié)果結(jié)合臨床上繼發(fā)耐藥情況，研究河南地區(qū)人群中p53、D-loop的多態(tài)性、突變和上皮性卵巢癌發(fā)生、耐藥的關(guān)系，獲得潛在的上皮性卵巢癌檢測指標(biāo)和易耐藥檢測指標(biāo)。通過對病患外

2、周血、傳代細胞、卵巢組織及切片中p53、線粒體基因差異研究，探討外周血中游離DNA檢測卵巢癌及評估耐藥性的可能，并對組織切片與實際新鮮組織多態(tài)性的差異比較，為臨床和后續(xù)試驗提供依據(jù)和借鑒。
　　方法：
　　1.卵巢組織切片中p53、線粒體基因的差異研究
　　選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“鄭大一附院”）和濮陽市人民醫(yī)院收治的在河南生活超過二十年的病患卵巢組織切片作為研究對象。其中60份上皮性卵巢癌組織石蠟標(biāo)本為首次

3、腫瘤細胞減滅術(shù)中收集到的，對照組61例卵巢癌陰性標(biāo)本為非癌患者卵巢癌組織切片。
　　2.外周血、傳代細胞、卵巢組織及切片中p53、線粒體基因差異研究
　　結(jié)果：
　　1.卵巢組織切片中p53、線粒體基因的差異
　　對121份臨床卵巢組織切片進行DNA提取，采用實時熒光定量PCR結(jié)合熔解曲線來優(yōu)化并監(jiān)控p53和D-loop區(qū)基因的PCR。
　　1.1所提取DNA OD260/OD280大都在1.7-2.0之間

4、，且提取量隨石蠟包埋組織存放時間的增加而減少。非癌患者組織切片中DNA含量和腫瘤患者組織切片中DNA含量無明顯差別。
　　1.2經(jīng)過多輪的實驗優(yōu)化、驗證，確定了p53基因和線粒體DNA的D-loop區(qū)基因不同片段在20μL熒光定量PCR體系中擴增的最佳條件。
　　1.3通過測序發(fā)現(xiàn)，與非癌患者卵巢p53基因相比，p53基因發(fā)現(xiàn)突變位點9個，多態(tài)性位點127個。與非癌患者卵巢D-loop基因相比，D-loop區(qū)基因發(fā)現(xiàn)突變位點

5、11個，多態(tài)性位點165個。
　　2.外周血、傳代細胞、卵巢組織及組織切片中p53、線粒體基因差異
　　2.1非癌患者細胞第一代細胞長滿培養(yǎng)瓶底部70％面積平均用時21天，腫瘤細胞平均用時18天。從第二代傳至第三代時，非癌患者卵巢細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70％面積平均用時15天，腫瘤細胞平均用時12天。采用DAB染色對上述第三代細胞進行了上皮細胞特有表面抗原CK19鑒定，結(jié)果顯示均為陽性。30例卵巢癌患者中17例卵巢上皮細胞體外培

6、養(yǎng)成功并傳至第五代，15例非癌患者卵巢細胞成功培養(yǎng)7例并傳至第五代。
　　2.2結(jié)果顯示:
　　2.2.1非癌患者術(shù)前外周血游離DNA含量為7.7±2.6ng/mL，在17份卵巢癌中，2例Ⅰ期患者含量為26.7±5.4ng/mL;6例Ⅱ期患者為151±29ng/mL;9例Ⅲ到Ⅳ期患者為234±32ng/mL。上皮性卵巢癌患者外周血中游離DNA含量較非癌患者升高明顯。
　　2.2.2新鮮卵巢組織及其石蠟包埋切片對p53基

7、因、D-loop區(qū)基因突變位點和多態(tài)性位點檢測效率一致。外周血中游離DNA檢出效率稍差，與前兩者相比，有4個p53基因多態(tài)性位點、2個D-loop區(qū)突變位點及11個D-loop區(qū)多態(tài)性位點未被檢測。但對于p53的7號外顯子44位密碼子由C突變?yōu)锳和D-loop區(qū)73位密碼子由A突變?yōu)镚兩者聯(lián)合檢測，仍可實現(xiàn)對17份陽性標(biāo)本的全檢出。顯示出p53的7號外顯子44位密碼子由C突變?yōu)锳和D-loop區(qū)73位密碼子由A突變?yōu)镚兩者聯(lián)合作為外周血

8、游離DNA檢測卵巢癌的潛在可能。
　　2.2.3第三代細胞較原卵巢組織新增p53基因突變位點2個，多態(tài)性位點11個，新增D-loop區(qū)基因多態(tài)性位點4個，提示傳代造成了基因的改變。但發(fā)現(xiàn)的潛在的上皮性卵巢癌p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)位點未發(fā)生改變，可作為后續(xù)細胞水平研究的檢測指標(biāo)。
　　結(jié)論：
　　選取臨床確診的90例上皮性卵巢癌患者和76例非癌患者的卵巢組織標(biāo)本作為研究對

9、象，通過對其p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因的測序，發(fā)現(xiàn)了潛在的上皮性卵巢癌p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)。對其中的45例病患的卵巢組織、組織切片、外周血及傳代卵巢上皮細胞標(biāo)本顯示進行進一步研發(fā)，發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌患者外周血中游離DNA含量較非癌患者升高明顯，石蠟包埋切片和外周血中游離DNA可替代新鮮卵巢組織作為基因多態(tài)性檢測對象。傳代雖然會造成基因的多態(tài)性變化，但發(fā)現(xiàn)的潛在的上皮性卵巢癌p5

10、3基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)位點未發(fā)生改變，可作為后續(xù)細胞水平研究的檢測指標(biāo)。
　　第二部分：p53、線粒體基因多態(tài)性與二甲雙胍在卵巢癌化療中增敏關(guān)系
　　目的：
　　利用卵巢細胞體外傳代第三代細胞進行耐藥馴化，模擬多次化療耐藥的現(xiàn)象，進而觀察二甲雙胍在紫杉醇、卡鉑治療中的增敏作用。通過檢測p53、D-loop基因多態(tài)性，研究p53、D-loop基因多態(tài)性與卵巢癌耐藥、二甲雙胍增

11、敏的關(guān)系。在動物模型中也采用患者卵巢組織細胞傳代第三代細胞建模，并采用非癌患者體血藥濃度用藥，模擬人在正常用藥下二甲雙胍對化療的增敏作用，觀察p53、D-loop基因多態(tài)性對增敏效果的影響。
　　方法：
　　1.二甲雙胍在傳代卵巢癌細胞中的增敏作用
　　選第一部分第二章成功傳代5次的17株癌變卵巢組織的第三代傳代細胞作為研究對象，并用SKOV3細胞株作為陽性對照。將每株細胞在稀釋為5×105/mL和1×105/mL兩個

12、濃度在96孔細胞培養(yǎng)板上各鋪48孔。5×105/mL的48孔細胞進行耐藥馴化，1×105/mL作為未馴化對照。耐藥馴化采用短時間間歇式馴化，并按照耐藥馴化所用紫杉醇(0、0.6、1.2μg/mL)、卡鉑(0、10、25μg/mL)、二甲雙胍（0、0.5、2.5μg/mL）不同水平的組合采用三因素三水平正交實驗的方法分為9個組別。在三次馴化后，仍按正交實驗組別分別加入馴化時所用藥物并培養(yǎng)72h，通過CCK8顯色觀察對實驗組細胞的抑制率，研

13、究二甲雙胍在卵巢癌不同化療中的增敏作用。
　　2.二甲雙胍在卵巢癌細胞裸鼠移植瘤中的增敏作用
　　用第一部分第二章成功傳代5次的17例癌變卵巢組織的第三代傳代細胞懸液接種子裸鼠皮下，構(gòu)建卵巢癌裸鼠移植瘤，比較卡鉑、紫杉醇聯(lián)合用藥與二甲雙胍、卡鉑、紫杉醇聯(lián)合用藥效果的差別。
　　以移植瘤直徑不小于6mm為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)，將各株細胞中建模成功的裸鼠分別隨機分為五組:第一組采用生理鹽水作為對照;第二組作為低劑量組:二甲雙胍4

14、00μg/只、紫杉醇80μg/只、卡鉑200μg/只;第三組為高劑量組:二甲雙胍400μg/只、紫杉醇400μg/只、卡鉑1000μg/只;第四組為低劑量對照組:紫杉醇80μg/只、卡鉑200μg/只;第五組為高劑量對照組:紫杉醇400μg/只、卡鉑1000μg/只。實驗結(jié)束時對小鼠進行解剖，根據(jù)對照組和實驗組移植瘤體積的大小比值進行抑制率計算。
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍在不同傳代卵巢癌細胞中的增敏作用
　　1.1

15、對17株細胞進行耐藥馴化，二甲雙胍具有明顯增敏作用的細胞12株。這12株細胞中9株有化療耐藥傾向。
　　1.2利用Exon6-198G+Exon8-67A+D-loop309T+D-loop446A可在12株增敏作用的細胞中檢測出11株，檢出率為11/12。利用Exon4-72G+D-loop309T可在12株增敏作用的細胞中檢測出8株，均為耐藥株，耐藥菌株檢測率8/9。
　　1.3二甲雙胍單獨使用，17株腫瘤細胞和7株非癌

16、患者細胞均在72h出現(xiàn)2.72-3.56％不等的抑制，在120h出現(xiàn)3.24-6.83％不等的抑制。二甲雙胍對細胞的抑制存在時間依賴，但不隨二甲雙胍的量改變，提示在這兩個人體濃度值范圍內(nèi)，二甲雙胍對細胞的抑制效果一致，但長期服用二甲雙胍效果會好些。
　　2.二甲雙胍在卵巢癌細胞裸鼠移植瘤中的增敏作用
　　17株細胞建模成功13株，最終成瘤大小和數(shù)量符合實驗要求的9株。裸鼠實驗表明，9組中包含細胞培養(yǎng)易耐藥細胞5個(S9、S2

17、7、S29、S1、S17)，其中4個(S27、S29、S1、S17)對鉑類有耐藥傾向，2個(S9、S27)對紫杉醇有耐藥傾向，1個(S9)鉑類、紫杉醇聯(lián)合耐藥傾向），紫杉醇、卡鉑敏感細胞4個。對于紫杉醇、卡鉑聯(lián)合用藥量高低進行比較，無論是否耐藥，均存在明顯的劑量正相關(guān)性。對于各劑量組中添加二甲雙胍的對照來看，S11、S6、S19、S26四株對紫杉醇、卡鉑敏感細胞中S19、S26表現(xiàn)出對二甲雙胍不敏感。其他細胞株的裸鼠實驗表明，低劑量的紫

18、杉醇、卡鉑在加入口服二甲雙胍后對其細胞抑制率增高明顯。與細胞水平實驗結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　二甲雙胍對卵巢癌耐藥細胞具有一定的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，p53的E7-44A和D-loop區(qū)73G兩者聯(lián)合檢測出的卵巢癌陽性細胞中具有Exon4-72G、D-loop309T的多態(tài)性的容易復(fù)發(fā)，且對二甲雙胍更為敏感，對于Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A基因型的卵巢癌細胞可使用二甲雙胍進行