核仁因子Bms1l在斑馬魚肝臟發(fā)育過程中的功能研究.pdf

1、肝臟的發(fā)生和發(fā)育是一個受到精密調(diào)控的復雜過程。人們利用模式生物的研究已經(jīng)逐漸了解了肝臟細胞的起源、形態(tài)發(fā)生及生長發(fā)育過程，也鑒定出了一些參與肝臟發(fā)育的重要因子。作為一種研究胚胎早期發(fā)育理想的模式生物，斑馬魚受到了越來越多研究人員的關(guān)注，尤其是結(jié)合目前迅速發(fā)展的CRISPR-Cas9等技術(shù)，使得相關(guān)的研究手段更加多樣、層次更加深入。
　　本課題綜合利用遺傳學、發(fā)育生物學、分子生物學和細胞生物學的研究方法，以斑馬魚為模式生物，系統(tǒng)研究

2、了bms1l基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的作用。通過ENU化學誘變篩選小肝臟表型的斑馬魚，我們課題組獲得了一個bms1l基因突變的斑馬魚品系bms1lsq163。研究顯示在bms1lsq163突變體中，bms1l基因第5外顯子發(fā)生了T到A的堿基突變，從而導致bms1l第154位密碼子從亮氨酸(CTG)置換為谷氨酰胺密碼(CAG)。相關(guān)表型分析發(fā)現(xiàn)bms1 lsq163突變體中，包括肝臟、外分泌胰腺和腸道在內(nèi)的消化器官生長發(fā)育受到特異性

3、的阻滯。進一步研究顯示，肝臟在早期起始和分化階段并沒有受到影響。為了深入驗證bms1l在肝臟發(fā)育過程中的重要作用，我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)對bms1l基因進行敲除，從而獲得了另一個品系的突變體bms1lzju1。在該突變體中，bms1l基因第2個外顯子上有13個堿基的插入，從而破壞了蛋白的正常編碼。由于Bms1l蛋白的完全缺失，bms1lzju1突變體有著更為嚴重的消化器官生長發(fā)育缺陷。我們在bms1 lsq163和bms1l

4、zju1兩個等位基因突變體的基礎(chǔ)上深入研究了Bms1l在斑馬魚肝臟發(fā)育過程中的功能。
　　前人在酵母的研究中發(fā)現(xiàn)Bmsl是一個核仁蛋白并且能與Rcl1蛋白形成復合物，共同參與核糖體前體RNA(pre-rRNA)的加工剪切。因此，Bms1對18S rRNA的成熟及核糖體生成有重要作用。根據(jù)以上研究，我們想了解斑馬魚中的同源基因bms1l是否有這些保守的功能。首先，通過免疫熒光共定位及免疫共沉淀實驗，我們發(fā)現(xiàn)Bms1l和Rcl1都是核

5、仁蛋白并且能夠互作，同時也用人的這兩個蛋白進一步驗證了該功能的保守性。其次，我們發(fā)現(xiàn)bms1lsq163和bms1lzju1突變體中pre-rRNA的加工過程和18S rRNA的生成均受到了影響，說明Bms1l確實在其中行使重要功能。另外，突變體肝臟細胞的核仁由于受到異常的pre-rRNA轉(zhuǎn)錄和加工影響，其形態(tài)也發(fā)生了明顯的改變。
　　在上述研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)bms1l突變體核仁中rDNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，這使得與轉(zhuǎn)錄方向相反

6、的DNA復制又受到嚴重阻滯，進而引起了DNA損傷反應。我們詳細研究了其中的P53信號通路，結(jié)果顯示在bms1l突變體中，P53及其異構(gòu)體的表達水平顯著提高，并且受P53調(diào)控的下游基因表達也被激活。由于P53的活化能夠抑制細胞周期的進行，我們在P53突變的背景下分析了bms1lsq163突變體中消化器官的拯救情況。結(jié)果顯示該雙重突變體能夠部分拯救小肝臟和小胰腺的表型。
　　接著，我們詳細分析了bms1lsq163突變體的肝臟細胞在細

7、胞周期中具體受阻滯的時期。結(jié)合細胞周期標志蛋白免疫熒光和Edu摻入實驗，我們發(fā)現(xiàn)突變體中處于S期DNA復制階段的肝臟細胞比例顯著上升，相應地，G2期至M期的比例顯著下調(diào)。通過Edu和Brdu不同時間點的雙標實驗，我們進一步驗證了bms1l突變體的肝臟細胞中存在旺盛的DNA復制現(xiàn)象，從而使得肝臟中非整倍體和多倍體細胞的比例上升。
　　綜合上述在bms1lsq163和bms1lzju1突變體中的研究，我們不僅驗證了Bms1l是一個功能