肉蓯蓉總苷對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶、p-tau蛋白表達(dá)及蛋白組學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、癡呆目前已經(jīng)成為一個(gè)重要的全球健康問題，隨著人口老齡化的日趨凸顯，癡呆的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)，這個(gè)問題的效應(yīng)預(yù)計(jì)將在未來被顯著放大。臨床表現(xiàn)以進(jìn)行性的認(rèn)知功能減退，記憶力下降，且伴隨行為異常，直至影響其生活自理能力。因此，研究掌握血管性癡呆癥的發(fā)病機(jī)制，最優(yōu)先考慮的問題應(yīng)該是預(yù)防和治療。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，無(wú)論什么原因，都可能導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。
　　肉蓯蓉(Cistanche deserticola Ma)是寄生在沙漠中樹木梭梭根

2、部的一種寄生植物，從梭梭中吸取所需的營(yíng)養(yǎng)成份及水。素有人間“沙漠人參”的美譽(yù)，具有極高的藥理學(xué)價(jià)值，是中國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥材。已有相關(guān)研究證明其具有抗衰老作用，調(diào)整內(nèi)分泌系統(tǒng)功能、促進(jìn)機(jī)體代謝，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的免疫能力，保護(hù)肝臟、心臟及腦血管系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)所用成分為肉蓯蓉總苷，是從肉蓯蓉中提取而得，被廣泛用來作為一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的中藥成分，采用現(xiàn)代藥理學(xué)的相關(guān)研究方法，多項(xiàng)研究表明肉蓯蓉總苷可以防止小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，抑制caspase-

3、3和caspase-8的活動(dòng)[2]而發(fā)揮其抗凋亡的影響。肉蓯蓉提取物通過增加神經(jīng)細(xì)胞分化，軸突長(zhǎng)度和突觸的形成來改善小鼠學(xué)習(xí)記憶[3]。但肉蓯蓉總苷對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)元的研究及對(duì)認(rèn)知功能的影響卻少有報(bào)道，特別是對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)元蛋白組學(xué)的構(gòu)成的研究國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究采用2-VO方法致局灶性腦缺血誘發(fā)VD大鼠模型，并使用肉蓯蓉總苷對(duì)模型進(jìn)行干預(yù)治療，通過行為性研究、蛋白組學(xué)技術(shù)及免疫組化等方法，為深入探討VD發(fā)病過程中可能的關(guān)鍵機(jī)

4、制，及其防治新措施提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 血管性癡呆大鼠模型制備及肉蓯蓉對(duì)血管性癡呆大鼠模型行為學(xué)的影響
　　VD是建立在腦血管病的基礎(chǔ)上，以記憶力、行為、認(rèn)知等功能缺損為主。最常見的病理學(xué)機(jī)制就是腦缺血導(dǎo)致的損害，是老年癡呆中僅次于阿爾茨海默氏病的第二種常見類型[4]。腦缺血可引起大腦缺氧，糖代謝程度降低等情況出現(xiàn)。海馬是學(xué)習(xí)記憶的高級(jí)活動(dòng)中樞，對(duì)腦組織缺血、缺氧等損傷很

5、敏感。本實(shí)驗(yàn)采用2-VO大鼠模型，結(jié)扎Wistar大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，這種模型制作簡(jiǎn)單，且穩(wěn)定，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的研究血管性癡呆的經(jīng)典動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　目的:制備大鼠血管性癡呆模型，研究肉蓯蓉總苷對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的改善作用。
　　方法:將Wistar大鼠編號(hào)，按照隨機(jī)數(shù)字表順序，隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD模型組、GCs治療組、奧拉西坦藥物對(duì)照組，后三組大鼠均用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(2-VO法)建立血管性癡呆模型，VD

6、模型組腹腔注射1ml生理鹽水，GCs組調(diào)整藥物濃度為給藥量1ml，腹腔注射劑量(10mg/kg/d)，奧拉西坦藥物對(duì)照組調(diào)整藥物濃度為給藥量1ml，腹腔注射劑量(450mg/kg/d)，連續(xù)用藥14天后，用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)四組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。
　　結(jié)果:(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)VD模型組的大鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，與假手術(shù)組比較有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜O.O5)，從第1天起，VD模型組和

7、假手術(shù)組逃避潛伏期差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)，第5天VD模型組逃避潛伏期為60.2±18.9s，假手術(shù)組則為32.5±9.9s，差異明顯增大。并且發(fā)現(xiàn)VD模型組隨著訓(xùn)練天數(shù)的延長(zhǎng)，逃避潛伏期也在逐漸縮短，訓(xùn)練第1天逃避潛伏期是82.7±22.3s，第5天逃避潛伏期縮短為60.2±18.9s，可能與大鼠肢體訓(xùn)練有關(guān)。
　　(2)肉蓯蓉總苷治療后，第4、5天大鼠逃避潛伏期分別為41.2±20.0s，38.6±15.2s，與VD

8、模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);肉蓯蓉總苷組與奧拉西坦藥物對(duì)照組及假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠經(jīng)歷Morris水迷宮平臺(tái)逃避潛伏期進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)從第1天起，VD模型組和假手術(shù)組逃避潛伏期差別不明顯，根據(jù)記錄的大鼠的路線圖分析，初始各組大鼠搜索平臺(tái)以隨機(jī)式或邊緣式為主，找到平臺(tái)的時(shí)間需要耗費(fèi)比較長(zhǎng)的時(shí)間，隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，第5天VD模型組逃避潛伏期較假手術(shù)組差異明顯增大。并且發(fā)現(xiàn)VD模型組隨著訓(xùn)練天

9、數(shù)的延長(zhǎng)，逃避潛伏期逐漸縮短，可能與大鼠肢體訓(xùn)練及從開始的隨機(jī)式或邊緣式尋找平臺(tái)，逐漸成為直線式尋找平臺(tái)有關(guān)。在使用肉蓯蓉總苷治療后，大鼠逃避潛伏期較VD模型組明顯縮短，提示給予肉蓯蓉總苷后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯改善。
　　第二部分 肉蓯蓉總苷對(duì)血管性癡呆大鼠蛋白組學(xué)及免疫組化研究
　　VD是由腦血管疾病引起的，以認(rèn)知功能損害為主，是老年癡呆的主要類型之一。本文旨在通過磷酸化tau蛋白(p-tau)免疫組化的方法及利用蛋白

10、質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析各組大鼠p-tau蛋白變化及VD模型海馬蛋白質(zhì)組構(gòu)成成分及使用肉蓯蓉總苷后，VD大鼠海馬蛋白質(zhì)組構(gòu)成發(fā)生的變化，為進(jìn)一步研究探討VD可能的致病機(jī)制提供依據(jù)，也為肉蓯蓉總苷從藥理角度研究中樞認(rèn)知功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:制備大鼠血管性癡呆模型，研究肉蓯蓉總苷對(duì)血管性癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙的改善作用，從蛋白質(zhì)組學(xué)及p-tau蛋白免疫組化方面探討其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　方法:將Wistar大鼠編號(hào)，隨機(jī)

11、分為假手術(shù)組、VD模型組、GCs治療組、奧拉西坦藥物對(duì)照組，后三組大鼠均用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(2-VO法)建立血管性癡呆模型，VD模型組腹腔注射1ml生理鹽水，GCs組調(diào)整藥物濃度為給藥量1ml，腹腔注射劑量(10mg/kg/d)，奧拉西坦藥物對(duì)照組調(diào)整藥物濃度為給藥量1ml，腹腔注射劑量(450mg/kg/d)，連續(xù)用藥14天后，用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)四組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。（同第一部分），完成行為學(xué)評(píng)估后取出大鼠海馬組織，用

12、蛋白組學(xué)技術(shù)分析VD模型組關(guān)鍵蛋白，以及給予GCs后蛋白質(zhì)組學(xué)變化。并通過免疫組化評(píng)估假手術(shù)組、VD模型組、GCs治療組、奧拉西坦藥物對(duì)照組的tau蛋白磷酸化水平。
　　結(jié)果:(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)VD模型組大鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng);與假手術(shù)組比較有顯著性差異(p＜0.01)。肉蓯蓉總苷治療后，VD大鼠逃避潛伏期縮短;肉蓯蓉總苷組與奧拉西坦藥物對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;（同前一部分）
　　(2)與假手術(shù)組比

13、較，VD模型組篩選出21個(gè)差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜(massspectrometry,MS)分析最終鑒定出3個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，分別是:硫氧還蛋白樣蛋白(thioredoxin-like protein1 TXL-1)，雙重特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶1(dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase1 MAPKK1)，二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白(Dihydropyrimidinase-

14、related protein2 Dpysl2)，1個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)是谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase GCL);與VD模型組比較，從GCs組發(fā)現(xiàn)共有15個(gè)差異蛋白點(diǎn)，最終鑒定上調(diào)蛋白2個(gè)，為蛋白熱休克蛋白75(heatshock protein75 kDa Hsp75)和肌動(dòng)相關(guān)蛋白3（actin-related protein3 Arp3），下調(diào)的蛋白1個(gè)，為角蛋白，Ⅱ型細(xì)胞骨架6A(keratin，ty

15、peⅡ cytoskeletal6A)。
　　(3)免疫組化圖象定量分析，胞漿呈棕黃色染色為p-tau蛋白，每個(gè)標(biāo)本各個(gè)區(qū)域隨機(jī)測(cè)量5個(gè)視野，每個(gè)視野選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞測(cè)量平均灰度值。VD模型組p-tau蛋白水平高于假手術(shù)組(P＜0.05)，使用GCs后，VD模型組p-tau蛋白水平較VD生理鹽水組明顯下降(P＜0.05)，與奧拉西坦藥物對(duì)照組無(wú)差別。
　　結(jié)論: VD模型組大鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng);表明

16、VD大鼠模型制模成功。肉蓯蓉總苷治療后，大鼠逃避潛伏期縮短;且肉蓯蓉總苷組與奧拉西坦藥物對(duì)照組間無(wú)明顯差異，表明肉蓯蓉總苷對(duì)血管性癡呆導(dǎo)致的神經(jīng)功能損害有保護(hù)作用（同前一部分）;經(jīng)歷Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的各組大鼠最終取出海馬組織，進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)VD模型組篩選出21個(gè)差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜分析最終鑒定出3個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，分別是:硫氧還蛋白樣蛋白，雙重特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶1，二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白，1個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)是谷胱甘肽合

17、成酶;從肉蓯蓉治療組發(fā)現(xiàn)共有15個(gè)差異蛋白點(diǎn)，最終鑒定上調(diào)蛋白2個(gè)，為蛋白熱休克蛋白75和肌動(dòng)相關(guān)蛋白3，下調(diào)的蛋白1個(gè)，為角蛋白，Ⅱ型細(xì)胞骨架6A，這些蛋白質(zhì)功能涉及能量代謝、抗氧自由基、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)元極性及軸突形成等多個(gè)病理生理過程，為進(jìn)一步研究探討VD可能的致病機(jī)制提供依據(jù)。免疫組化結(jié)果提示:VD模型組tau蛋白磷酸化水平(p-tau)較假手術(shù)組明顯增高，提示與微管蛋白結(jié)合程度下降，導(dǎo)致維持微管功能穩(wěn)定性降低，造成神經(jīng)纖維退化甚