藍(lán)藻與紅藻中藻膽蛋白的活性構(gòu)象研究.pdf

1、藻膽體是存在于藍(lán)藻和紅藻中的一類捕光復(fù)合物(light-harvesting complex),是藍(lán)藻和紅藻光系統(tǒng)最主要的捕光天線(antennae),由多種藻膽蛋白和連接蛋白組成。根據(jù)光譜性質(zhì),藻膽蛋白可以劃分為三個(gè)大類:異藻藍(lán)蛋白、藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白,此外在部分藍(lán)藻中還存在藻紅藍(lán)蛋白。藻膽蛋白以共價(jià)鍵連接多個(gè)色素基團(tuán),這些色素基團(tuán)使得藻膽蛋白具有十分優(yōu)良的捕獲和傳遞光能的能力。
　　 在藍(lán)藻和紅藻細(xì)胞中,水溶性的藻膽蛋白位于

2、類囊體膜的表面,直接暴露于細(xì)胞質(zhì)或者類囊體基質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生波動(dòng)的時(shí)候,藻膽蛋白將受到直接影響,其構(gòu)象很容易發(fā)生擾動(dòng)。對(duì)于藻膽蛋白來(lái)說(shuō),在構(gòu)象發(fā)生一定程度變化的時(shí)侯仍能維持捕獲和傳遞光能的能力,對(duì)藍(lán)藻和紅藻在逆境條件下的生存是非常重要的。很多種類藻膽蛋白的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到了解析,這些晶體結(jié)構(gòu)提供了藻膽蛋白在平衡態(tài)下的靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息。而藻膽蛋白在生理?xiàng)l件下的溶液中具有功能活性的構(gòu)象,包括在受到環(huán)境干擾而發(fā)生結(jié)構(gòu)擾動(dòng)時(shí)的構(gòu)象,必然是一個(gè)

3、動(dòng)態(tài)的變化范圍。晶體結(jié)構(gòu)只是提供了藻膽蛋白眾多可能的構(gòu)象當(dāng)中的一種靜態(tài)信息。因而2009年Liu等提出了藻膽蛋白活性構(gòu)象的概念(Liu et al.,2009),并且把對(duì)藻膽蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的分析與藻膽蛋白在溶液中活性構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化的研究相結(jié)合,研究了在溶液中具有功能活性的藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系。
　　 本文對(duì)來(lái)源于藍(lán)藻和紅藻的各種種類的藻膽蛋白的活性構(gòu)象進(jìn)行了系統(tǒng)研究,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 一、異藻

4、藍(lán)蛋白高效分離純化方法的建立
　　 異藻藍(lán)蛋白是存在于藍(lán)藻和紅藻中的一類色素蛋白,在生物技術(shù)領(lǐng)域尤其是作為熒光標(biāo)記物方面有著非常廣泛的應(yīng)用和巨大的市場(chǎng)價(jià)值。但異藻藍(lán)蛋白無(wú)論在藍(lán)藻中還是在紅藻中都是一種低豐度的蛋白,含量很低,迄今為止仍缺乏高效制備型的分離純化技術(shù)?，F(xiàn)已報(bào)道的純化技術(shù)均無(wú)法進(jìn)行大量、高純度的異藻藍(lán)蛋白提取。本論文首先建立了一套從鈍頂螺旋藻中高效、快速、低成本制備型分離純化異藻藍(lán)蛋白的方法。粗提液首先經(jīng)過(guò)預(yù)處理,然后

5、使用羥基磷灰石富集后再提取的方法,就能非常方便的提取出大量的異藻藍(lán)蛋白。這種方法不僅能夠在短時(shí)間快速提取出大量的異藻藍(lán)蛋白,而且得到的異藻藍(lán)蛋白純度系數(shù)(A650/A280)達(dá)到2.0。提取出的異藻藍(lán)蛋白再通過(guò)一步離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步純化,得到高純度的異藻藍(lán)蛋白,其純度系數(shù)(A650/A280)達(dá)到5.0,大大超過(guò)了國(guó)際上常用的商品化異藻藍(lán)蛋白純度系數(shù)(A650/A280)4.6的純度標(biāo)準(zhǔn)。
　　 二、鈍頂螺旋藻異藻藍(lán)蛋白活性

6、構(gòu)象問(wèn)題的研究
　　 異藻藍(lán)蛋白是藻膽體核心部分的主要組成成分,能夠吸收光能并且將能量傳遞到類囊體膜上的光系統(tǒng)中,推動(dòng)光合作用順利進(jìn)行。本工作首先從螺旋藻中分離純化了異藻藍(lán)蛋白,然后以其為實(shí)驗(yàn)材料對(duì)異藻藍(lán)蛋白光譜性質(zhì)受溶液pH變化的影響做了研究。以紫外-可見(jiàn)光吸收光譜表征異藻藍(lán)蛋白對(duì)光能的吸收能力,發(fā)現(xiàn)異藻藍(lán)蛋白在650nm處的最大吸收峰能夠在pH4到10的范圍之內(nèi),其峰形和峰值都能保持比較穩(wěn)定,而在酸性環(huán)境中pH降低到4以下6

7、50nm處光吸收則完全消失,吸收峰藍(lán)移至620nm。堿性環(huán)境中pH升高到11時(shí)異藻藍(lán)蛋白在650nm的特征吸收峰才完全消失。異藻藍(lán)蛋白在pH4到10范圍之內(nèi)穩(wěn)定的光吸收能力通過(guò)熒光激發(fā)光譜的檢測(cè)也得到了印證。使用熒光發(fā)射光譜表征異藻藍(lán)蛋白的光能傳遞能力,發(fā)現(xiàn)異藻藍(lán)蛋白的特征發(fā)射光譜峰位于660nm處,而且在pH值4到10的范圍之內(nèi)能夠穩(wěn)定的維持其發(fā)射熒光的強(qiáng)度,說(shuō)明其光能傳遞能力是穩(wěn)定的。使用圓二色譜檢測(cè)了異藻藍(lán)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)異

8、藻藍(lán)蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)是α-螺旋,但是α-螺旋的含量隨著溶液環(huán)境pH值的變化而發(fā)生一定程度的變動(dòng)。同時(shí)還通過(guò)紫外-可見(jiàn)光吸收光譜、熒光光譜和可見(jiàn)光區(qū)圓二色譜分析了異藻藍(lán)蛋白聚集狀態(tài)的改變,發(fā)現(xiàn)異藻藍(lán)蛋白在pH從4到10的范圍之內(nèi),能夠穩(wěn)定的維持住其具有活性功能的三聚體聚集形式。因此光譜分析結(jié)果表明異藻藍(lán)蛋白在一定pH值范圍內(nèi),其光能吸收和傳遞的能力保持在一個(gè)相對(duì)較穩(wěn)定的范圍,同時(shí)異藻藍(lán)蛋白維持聚集體的形式,而其二級(jí)結(jié)構(gòu)則會(huì)發(fā)生一定程度的

9、擾動(dòng)。在pH值比較極端的情況下,異藻藍(lán)蛋白三聚體發(fā)生解聚,二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化,其光能吸收和傳遞能力迅速被破壞。通過(guò)分析異藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)異藻藍(lán)蛋白α亞基和β亞基直接相互作用面上有一些關(guān)鍵的相互作用位點(diǎn)。因此,可能是通過(guò)這些相互作用位點(diǎn),異藻藍(lán)蛋白能夠在局部結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的構(gòu)象變化的情況下維持其蛋白的基本架構(gòu)穩(wěn)定,從而保證了其生理功能的穩(wěn)定。
　　 三、鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白活性構(gòu)象問(wèn)題的研究
　　 藻藍(lán)蛋白是藍(lán)藻藻

10、膽體桿部的最主要組成成分,具有執(zhí)行吸收光能并且將光能傳遞到藻膽體核心部位的重要功能。本論文選擇鈍頂螺旋藻作為實(shí)驗(yàn)材料,分離純化了藻藍(lán)蛋白,對(duì)藻藍(lán)蛋白在不同溶液pH值影響下的結(jié)構(gòu)與功能的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。對(duì)藻藍(lán)蛋白的光能吸收能力(以紫外-可見(jiàn)光吸收光譜表征)和光能傳遞能力(以熒光光譜表征)進(jìn)行了監(jiān)測(cè),并且研究了藻藍(lán)蛋白在功能受到影響時(shí)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化(以圓二色譜表征)和聚集狀態(tài)的變化(以可見(jiàn)光區(qū)圓二色譜進(jìn)行表征)。藻藍(lán)蛋白在中性溶液

11、環(huán)境中吸收光譜的最大吸收峰位于620nm處,在酸性環(huán)境下藻藍(lán)蛋白會(huì)呈現(xiàn)一個(gè)復(fù)雜的變化過(guò)程,最大吸收峰會(huì)從620nm處藍(lán)移到615nm處,并且通過(guò)二階導(dǎo)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)峰形發(fā)生了變化。但是可見(jiàn)光區(qū)的吸收峰面積沒(méi)有減少反而有所增強(qiáng)。在pH值從3.5到10這一比較寬泛的范圍內(nèi),藻藍(lán)蛋白對(duì)光能的吸收能力保持穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)藻藍(lán)蛋白熒光激發(fā)光譜的研究也發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白能夠在pH3.5到10的范圍之內(nèi)保持穩(wěn)定的光吸收能力。藻藍(lán)蛋白的熒光發(fā)射光譜最大發(fā)射峰在639

12、nm處,其熒光發(fā)射峰的峰位隨pH的變化有微小移動(dòng),但是峰值變化較小,反應(yīng)了其能量傳遞能力的穩(wěn)定性。通過(guò)分析藻藍(lán)蛋白可見(jiàn)光區(qū)圓二色譜647nm處肩峰的譜線變化,發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白在功能保持穩(wěn)定的pH范圍之內(nèi)聚集狀態(tài)也是保持穩(wěn)定的。通過(guò)使用紫外區(qū)圓二色譜對(duì)藻藍(lán)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白中的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主,在藻藍(lán)蛋白功能和聚集狀態(tài)保持穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi),其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的含量有一定程度的波動(dòng)。因此,對(duì)光譜結(jié)果的分析

13、表明藻藍(lán)蛋白在溶液環(huán)境發(fā)生一定程度擾動(dòng)的時(shí)候,能夠保持其天然聚集狀態(tài),同時(shí)其對(duì)光能的吸收和傳遞的能力能夠在一定范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定,而此時(shí)其二級(jí)結(jié)構(gòu)卻發(fā)生了一定程度的擾動(dòng)。隨后分析了藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu),重點(diǎn)研究了藻藍(lán)蛋白分子內(nèi)部的亞基之間維持聚集狀態(tài)的相互作用面,發(fā)現(xiàn)在α亞基和β亞基之間相互接觸的面上的一些相互作用區(qū)域中存在一些關(guān)鍵的作用位點(diǎn)。通過(guò)這些相互作用位點(diǎn),藻藍(lán)蛋白得以維持其穩(wěn)定的聚集狀態(tài)。因此在受到一定程度的環(huán)境干擾時(shí),這些相互