ATP水解酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺小鼠的干預(yù)研究.pdf

1、目的：矽肺是由長(zhǎng)期慢性吸入二氧化硅（silicondioxide，SiO2）粉塵引起的職業(yè)性肺疾病。由于起病隱匿、持續(xù)進(jìn)展且沒有有效的治療手段，矽肺已經(jīng)成為威脅發(fā)展中國(guó)家、特別是我國(guó)相關(guān)從業(yè)人員健康的非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前普遍認(rèn)為，肺部巨噬細(xì)胞可以吞噬SiO2顆粒，釋放一系列的炎癥介質(zhì)，在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要的作用。而巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性，本課題組前期研究表明，干預(yù)巨噬細(xì)胞表型偏移可以減輕矽肺早期炎癥及晚期的纖維化表現(xiàn)。而胞

2、外三磷酸腺苷（extracellularadenosinetriphosphate，eATP）作為機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)細(xì)胞之間信息交流的重要分子和內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，可以影響巨噬細(xì)胞的表型極化。使用三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase，Apy）降解呼吸道ATP能否減輕矽肺小鼠的炎癥和纖維化尚未明確。因此，本研究做出假設(shè)：使用Apy局部耗竭eATP可以通過調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞表型偏移，對(duì)矽肺的炎癥和纖維化起到干預(yù)作用。
　　方法：
　　1

3、、200只雄性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為矽肺造模組（silica組），生理鹽水組（NS組），矽肺造模+溶劑對(duì)照組（Silica+NS組）及矽肺造模+Apy組（Silica+Apy），每組均為50只。2％異氟烷輕度麻醉小鼠后，silica組經(jīng)口咽吸入SiO2懸濁液建立小鼠矽肺模型，NS組給予等體積生理鹽水；Silica+Apy組在造模同時(shí)給予0.8μL0.5mg/mLApy，并在造模后4h重復(fù)給藥一次，Silica+NS組給予等量的生

4、理鹽水。造模后3h、7d、14d、28d、56d按標(biāo)準(zhǔn)方法取材。灌洗組小鼠進(jìn)行經(jīng)氣管肺泡灌洗，取肺泡灌洗液（BronchoalveolarLavageFluid，BALF）進(jìn)行灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及相關(guān)細(xì)胞因子的ELISA檢測(cè)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞表型；對(duì)非灌洗組右上肺進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，分別進(jìn)行HE染色，苦味酸-天狼星紅染色，α-SMA、NLRP3+F4/80免疫熒光染色，左肺提取總RNA，

5、進(jìn)行IL-1β、CCL2、NLRP3、COLⅠ、COLⅢ表達(dá)量檢測(cè)，右下中肺進(jìn)行ATP含量檢測(cè)。
　　2、取5只雄性C57BL/6J小鼠，頜下靜脈叢取外周靜脈血，分選流式分選出外周血單核細(xì)胞；小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后進(jìn)行經(jīng)氣管肺泡灌洗，將肺泡灌洗液細(xì)胞及外周血單核細(xì)胞進(jìn)行甩片、固定及破膜后進(jìn)行P2X7R免疫熒光染色。
　　結(jié)果：
　　1、肺組織ATP檢測(cè)表明，矽肺造模后肺組織ATP水平明顯升高，給予Apy治療后可以顯著減

6、低肺組織ATP的含量，達(dá)到局部耗竭ATP的目的。
　　2、7d肺組織HE染色及相應(yīng)的炎癥評(píng)分表明，與NS組相比，Silica組小鼠肺組織表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增寬、破壞及炎癥評(píng)分增高。BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，Silica組炎癥細(xì)胞的總數(shù)、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著升高，BALF上清IL-1β、CCL2蛋白水平及肺組織IL-1β、CCL2、NLRP3基因水平的表達(dá)量均顯著增高，肺組織NLRP3+F4/80免疫熒光染色表明，

7、矽肺小鼠肺組織NLRP3陽(yáng)性巨噬細(xì)胞明顯增多。而Silica+Apy組與Silica+NS組相比，肺組織炎癥表現(xiàn)、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯緩解，IL-1β、CCL2、NLRP3基因蛋白水平的表達(dá)均下降。
　　3、28d肺組織苦味酸-天狼星紅染色表明，Silica組小鼠肺組織在暗場(chǎng)可以觀察到大量的粗大的紅色膠原及細(xì)小的黃綠色膠原，基于苦味酸-天狼星紅染色的半定量分析表明矽肺組膠原容積分?jǐn)?shù)顯著升高，肺組織α-SMA免疫熒光染色表明矽肺組α-

8、SMA陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增高，肺組織COLⅠ、COLⅢ的表達(dá)量增高；而Silica+Apy組與Silica+NS組相比，肺組織紅色及黃綠色膠原區(qū)域、膠原容積分?jǐn)?shù)、α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著下降，COLⅠ、COLⅢ基因水平的表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　4、7d、14d造模后，相對(duì)于NS組，Silica組小鼠外周血單核細(xì)胞Ly6Chi亞群比例顯著提高，肺泡巨噬細(xì)胞、肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞M2表型比例增高，而Apy干預(yù)可以顯著逆轉(zhuǎn)矽肺造模導(dǎo)致的上述