大鼠BDNF基因真核表達(dá)及其產(chǎn)物對BMSCs定向誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作為神經(jīng)生長因子家族成員，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著密切關(guān)系，不僅對中樞神經(jīng)元的發(fā)育、增殖分化、存活起重要作用，而且對損傷后神經(jīng)元的修復(fù)與功能重塑也起重要作用。近年來神經(jīng)生長因子家族一些成員紛紛被克隆并應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的防治。 本試驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^RT-PCR技術(shù)及基因克隆的方法，構(gòu)建含大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因的真核

2、表達(dá)載體pEGFP(N1)-BDNF，以重組質(zhì)粒pEGFP(N1)-BDNF作為外源性基因，與脂質(zhì)體一起轉(zhuǎn)染到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)中，通過熒光顯微鏡觀察，并結(jié)合免疫熒光化學(xué)染色方法鑒定基因工程細(xì)胞是否穩(wěn)定表達(dá)BDNF蛋白，同時根據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定。BMSCs細(xì)胞能否在其表達(dá)的BDNF蛋白誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 BDNF真核表達(dá)載體pEGFP(N1)-BDNF的構(gòu)建：從2-3日齡大鼠腦組織中抽提總R

3、NA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增BDNF基因片段，將此片段克隆入PMD-18-T載體，酶切反應(yīng)鑒定。雙酶切BDNF-T載體和空質(zhì)粒pEGFP(N1)，將所獲目的片段和線性空載體用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP(N1)-BDNF。并進(jìn)行酶切反應(yīng)鑒定及DNA測序。測序結(jié)果與GenBank提供的已知序列比較，證明所克隆的BDNF基因從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG全長共750bp，與報(bào)道的序列完全相同。 pEG

4、FP(N1)-BDNF在BMSCs中的表達(dá)：首先進(jìn)行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的采集與貼壁法培養(yǎng)，并反復(fù)傳代，使BMSCs得到擴(kuò)增和純化，獲得高純度的BMSCs。然后應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP(N1)-BDNF轉(zhuǎn)染到BMSCs中，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡觀察及BDNF免疫熒光化學(xué)染色鑒定。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs 18h后，在倒置熒光顯微鏡下，pEGFP(N1)-BDNF和pEGFP(N1)空載體組鏡下可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，GFP呈陽性

5、的BMSCs細(xì)胞數(shù)約為60％。通過BDNF蛋白的免疫熒光化學(xué)方法鑒定成功轉(zhuǎn)染pEGFP(N1)-BDNF組的BMSCs，陽性BMSCs細(xì)胞數(shù)約為30％，提示BDNF在細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果可以看出，陽性細(xì)胞逐漸表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。 結(jié)果表明通過基因重組的方法將BDNF基因己克隆到質(zhì)粒pEGFP(N1)上，采用限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列分析鑒定表明成功構(gòu)建成真核表達(dá)載體pEG