基于磁珠液相免疫反應(yīng)的電阻抗檢測(cè)系統(tǒng)及其應(yīng)用技術(shù)研究.pdf

1、目的：
　　將基于磁珠的液相免疫檢測(cè)與電阻抗技術(shù)有機(jī)融合，解決傳統(tǒng)電化學(xué)檢測(cè)中生物活化電極作為耗材所帶來的成本高、穩(wěn)定性差、集成度低等問題。預(yù)期建立以生物活化磁珠作為液相均質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)、以電化學(xué)敏感電極作為定量分析系統(tǒng)、以流路系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)化銜接的基于磁珠液相免疫反應(yīng)的電化學(xué)系統(tǒng)，從而為實(shí)現(xiàn)POCT檢測(cè)的自動(dòng)化奠定基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上將其應(yīng)用于腸出血性大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌等食源性致病微生物的檢測(cè)以及人心肌肌鈣蛋白Ⅰ等臨床檢驗(yàn)項(xiàng)

2、目的檢測(cè)，從而對(duì)檢測(cè)性能進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。
　　方法：
　　1.酶促反應(yīng)檢測(cè)體系探索優(yōu)化:對(duì)堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶及其酶促電化學(xué)底物進(jìn)行篩選優(yōu)化，以獲得穩(wěn)定、高催化產(chǎn)率、高電化學(xué)活性的產(chǎn)物;
　　2.磁珠液相免疫檢測(cè)系統(tǒng)建立:以磁珠作為液相分散的檢測(cè)載體，在磁珠表面共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記抗體，通過優(yōu)化抗體標(biāo)記量及標(biāo)記過程，獲得最優(yōu)的標(biāo)記效率，將標(biāo)記有抗體的磁珠用于雙抗體夾心法捕獲抗原，同時(shí)優(yōu)化磁珠大小及磁珠用量等實(shí)驗(yàn)因素;

3、>　　3.電阻抗定量分析系統(tǒng)建立:根據(jù)酶促產(chǎn)物的電化學(xué)特性，對(duì)電化學(xué)敏感電極的結(jié)構(gòu)（平面電極和叉指電級(jí)）及測(cè)量參數(shù)（直流偏置）進(jìn)行優(yōu)化，獲得兼顧穩(wěn)定性與敏感性的電極和測(cè)量參數(shù)，用于酶促產(chǎn)物的阻抗測(cè)量;
　　4.系統(tǒng)集成及其應(yīng)用與性能評(píng)價(jià):將阻抗系統(tǒng)與磁珠液相免疫檢測(cè)系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合，用于腸出血性大腸桿菌O157∶H7和人心肌肌鈣蛋白Ⅰ的檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.堿性磷酸酶是一種脫磷酸酶，由于磷酸根離子的存在，導(dǎo)致酶催化前

4、后溶液的阻抗值變化不明顯，不適用于阻抗定量測(cè)量系統(tǒng);而辣根過氧化物酶具有氧化還原能力，酶催化過程中發(fā)生電子得失，釋放離子，導(dǎo)致酶催化前后溶液的阻抗值發(fā)生變化，因此適用于阻抗定量測(cè)量系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶催化后溶液的阻抗值下降。
　　2.采用EDC/NHS法將抗體共價(jià)偶聯(lián)到帶有羧基的磁珠表面，磁珠與抗體的用量比為5∶1時(shí)標(biāo)記效果最佳;雙抗體夾心法檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7時(shí)，磁珠用量為1 mg/mL時(shí)的捕獲率最高;0.301μm、0

5、.93μm和1.9μm三種粒徑的磁珠在雙抗體夾心檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7時(shí)，0.93μm的磁珠檢測(cè)效果最好。
　　3.平面電極和叉指電極均可用于酶促產(chǎn)物的阻抗測(cè)量，叉指電極與溶液的接觸面積更大更完全，測(cè)得的阻抗值較小，陽性值與陰性值的比值更大，更適用于阻抗定量測(cè)量系統(tǒng);直流偏置對(duì)平面電極和叉指電極的測(cè)量結(jié)果均沒有影響，實(shí)驗(yàn)中直流偏置設(shè)置為0 mV。
　　4.將磁珠液相免疫檢測(cè)系統(tǒng)與阻抗系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合，測(cè)量大腸桿菌O157∶H

6、7的最低檢測(cè)限可達(dá)102 CFU/mL，測(cè)量范圍為102 CFU/mL-106CFU/mL。
　　結(jié)論：
　　辣根過氧化物酶-四甲基鄰苯胺(HRP-TMB)反應(yīng)體系可用于阻抗定量測(cè)量系統(tǒng)，經(jīng)與磁珠液相免疫反應(yīng)相結(jié)合，可應(yīng)用于腸出血性大腸桿菌O157∶H7的定量檢測(cè)，最低檢測(cè)限可達(dá)102 CFU/mL或更低。由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不涉及電極表面的修飾處理，電極可使用很長(zhǎng)一段時(shí)間而無需更換，因此解決了傳統(tǒng)電化學(xué)檢測(cè)中生物活化電極作為