MC1R失功能對黑皮質(zhì)素抗蛋白尿作用影響的研究.pdf

1、在中國，原發(fā)性腎小球病是導(dǎo)致終末期腎臟病(End stage renaldisease，ESRD)的首位病因[1]，在美國等西方歐美國家，它是繼糖尿病腎病和高血壓腎損害之后的第三位病因[2]。蛋白尿，作為腎小球病最突出的臨床表現(xiàn)，已被證實(shí)是加速腎功能惡化、卒中、心血管死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3-6]。雖然血管緊張素拮抗劑和免疫抑制在原發(fā)性腎小球病的治療中取得了不俗的療效[7-9]，但是難治性蛋白尿始終是一大臨床難題。因此，尋求更為有效的治療

2、方案促進(jìn)蛋白尿緩解改善腎損傷是勢在必行的。近期，大量證據(jù)顯示黑皮質(zhì)素系統(tǒng)是治療蛋白尿的新靶點(diǎn)[10]。
　　作為4種天然黑皮質(zhì)素之一，促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)于上世紀(jì)50年代開始被廣泛用于腎病綜合征的治療[11,12]。研究顯示，ACTH對多種腎小球病有效，包括特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy，iMN)[13-17]、微小

3、病變病(Minimal change disease，MCD)[14-161、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(Focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)[14-16，18，19]和免疫球蛋白A腎病(Immunoglobulin A nephropathy，IgAN)[16]，這提示黑皮質(zhì)素的治療靶點(diǎn)應(yīng)該是或很可能是所有腎小球病的共同致病通路。因此，足細(xì)胞，作為腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，大量蛋白尿發(fā)病機(jī)制

4、的重要參與者[20-23]，就有可能成為黑皮質(zhì)素的作用靶細(xì)胞。已經(jīng)有研究顯示，黑皮質(zhì)素可能通過對足細(xì)胞的直接保護(hù)作用發(fā)揮抗蛋白尿和腎臟保護(hù)作用[24,25]。
　　黑皮質(zhì)素通過與5種不同受體結(jié)合而發(fā)揮下游的生物學(xué)效應(yīng)[26-28]，而究竟哪種受體介導(dǎo)了黑皮質(zhì)素的非激素依賴的抗蛋白尿和腎臟作用尚存有爭議。本研究利用自然發(fā)生黑皮質(zhì)素受體1(Melanocortin receptor1，MC1R)基因突變的人類和小鼠探討MC1R失功能對

5、黑皮素抗蛋白尿和腎臟保護(hù)作用的影響。
　　第一部分 MC1R失功能對黑皮質(zhì)素治療激素抵抗的腎小球病療效的影響
　　目的：
　　觀察黑皮質(zhì)素是否對MC1R失功能的激素抵抗的腎小球病患者有效。
　　方法：
　　回顧性選擇自2009年3月至2015年10月就診于瑞典隆德大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科的、先天性紅發(fā)、激素抵抗的腎小球病患者。收集這些患者的外周血分離單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine mo

6、nophosphate，cAMP)釋放實(shí)驗(yàn)，同時(shí)提取全基因組DNA進(jìn)行MC1R測序。
　　結(jié)果：
　　1.4例先天性紅發(fā)患者M(jìn)C1R存在D84E或R151C突變。
　　2.4例患者突變的MC1R不能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP的釋放。
　　3.ACTH治療對這4例MC1R失功能的激素抵抗的腎小球病有效。
　　結(jié)論：
　　1.4例MC1R突變的先天性紅發(fā)患者存在MC1R的基因失功能。
　　2.ACTH可有效

7、治療MC1R失功能的激素抵抗的腎小球病患者。
　　3.MC1R失功能不影響ACTH非激素依賴的抗蛋白尿作用。
　　第二部分 MC1R失功能對黑皮質(zhì)素緩解腎小球病模型小鼠尿蛋白的影響
　　目的：
　　觀察黑皮質(zhì)素對腎小球病模型鼠的抗蛋白尿和腎臟保護(hù)作用，探討MC1R失功能對這一作用的影響。
　　方法：
　　1.長期飼養(yǎng)WT和e/e小鼠，觀察二者除被毛顏色外是否還存在其他生理異常。
　　2.應(yīng)用脂多

8、糖(Lipopolysaccharide，LPS)和阿霉素(Adriamycin，ADR)在野生型(Wild type，WT)和Mc1re/e陰性純合基因突變(e/e)小鼠誘導(dǎo)腎小球病模型，同時(shí)給予腎小球病模型鼠黑皮質(zhì)素干預(yù)。
　　3.檢測小鼠尿蛋白定量、腎小球結(jié)構(gòu)改變、腎小球中足細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)評價(jià)LPS和ADR所致的腎臟損傷及黑皮質(zhì)素的保護(hù)效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.WT和e/e小鼠除被毛顏色外其他生理功能無

9、異常。
　　2.LPS和ADR可在WT和e/e小鼠成功誘導(dǎo)出腎小球病模型，WT和e/e小鼠的尿蛋白和腎小球的損傷程度相似，二者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.黑皮質(zhì)素可減輕LPS和ADR所致的蛋白尿和腎小球損傷，減輕程度在WT和e/e小鼠沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.MC1R失功能不影響e/e小鼠的正常生理功能。
　　2.MC1R失功能性不影響黑皮質(zhì)素對LPS和ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞病的抗蛋白尿和腎臟保護(hù)作用

10、。
　　第三部分 MC1R缺失在黑皮質(zhì)素減輕LPS和ADR所致足細(xì)胞損傷中的作用
　　目的：
　　觀察黑皮質(zhì)素對足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，探討探討MC1R失功能對這一作用的影響。
　　方法：
　　1.自WT和e/e小鼠分離腎小球并提取原代足細(xì)胞，分別給予LPS和ADR刺激，用應(yīng)用黑皮質(zhì)素干預(yù)。
　　2.通過檢測白蛋白流入量、細(xì)胞活力、足細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白、足細(xì)胞遷移率評價(jià)細(xì)胞的損傷程度。
　　結(jié)果：<

11、br>　　1.LPS和ADR和導(dǎo)致足細(xì)胞單層濾過屏障功能下降，細(xì)胞活力下降、細(xì)胞固有蛋白的表達(dá)減少、損傷相關(guān)蛋白的重新表達(dá)以及細(xì)胞遷移的加快，在WT和e/e小鼠的足細(xì)胞，LPS和ADR所致的損傷程度類似，二者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.黑皮質(zhì)素可減輕LPS和ADR所致的足細(xì)胞損傷，減輕程度在WT和e/e小鼠沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.LPS和ADR可導(dǎo)致直接的足細(xì)胞損傷。
　　2.MC1R失功能不影響黑皮