臨床分離的紅色毛癬菌肉芽腫株生物學(xué)性狀及毒力的初步研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：紅色毛癬菌肉芽腫株和淺表感染株的生物學(xué)性狀和基因型的比較研究
　　目的：研究紅色毛癬菌肉芽腫株和淺表感染臨床株生物學(xué)性狀和基因型。
　　方法：收集南京總醫(yī)院皮膚科門診2013年4月-2015年5月就診的3例紅色毛癬菌肉芽腫患者和2015年4月就診的11例淺表感染患者的臨床分離菌株。紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCCMYA4438和須癬毛癬菌CMCC(F)T5a。
　　(1)將

2、臨床分離菌株進(jìn)行純化，傳代，然后接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置于27℃培養(yǎng)箱下，培養(yǎng)10天。觀察菌落外觀、質(zhì)地及背面顏色。采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)對分離菌株進(jìn)行鑒定。
　　(2)將全部分離株接種馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，28℃孵育7d挑取紅色毛癬菌菌落置入研磨器中，加入生理鹽水，研磨后制成均勻菌懸液，用血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×107CFU/mL。
　　(3)將肉芽腫株和標(biāo)準(zhǔn)株菌ATCCMYA4438懸液以移液槍

3、取10μL菌懸液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中，每株接種18個，分別置于25℃、27℃、35℃、37℃、39℃、41℃各3個。淺表感染分離株菌懸液30株以移液槍取10μL菌懸液接種于PDA平板中，每株接種6個，分別置于27℃、37℃下各3個。逐日觀察比較菌落形態(tài)大小變化，觀察3周，拍照并測量記錄下14天和21天時菌落最外直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，取平均值。
　　(4)按照美國國家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的M38-A2方案采用微量液體稀釋

4、法在體外進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在含抗真菌藥物的96孔板的1-11列孔加入2倍終濃度的菌懸液，27℃溫箱孵育，7天后觀察結(jié)果。4種抗真菌藥物為伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑。檢測分離株最低抑菌濃度(MIC)，以ATCCMYA4438為質(zhì)控株。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作至少3次，取平均值。
　　(5)用Bi-opsin真菌基因組DNA提取試劑盒按照說明提取菌株DNA，對菌株TRS-1(NTS區(qū)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)亞單位1)、TRS-2區(qū)(NTS區(qū)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)亞單

5、位2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定菌株基因型。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測:用1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠程序系統(tǒng)中觀察結(jié)果，并采集保存圖像，剩余肉芽腫株P(guān)CR產(chǎn)物送Invitrogen貿(mào)易有限公司測序，測序結(jié)果與genebank基因序列比對分析。
　　(6)采用SPSS20軟件，運(yùn)用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計資料的方差分析和配對樣本t檢驗(yàn)分本析對菌落直徑數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:(1)菌株鑒定結(jié)果3株肉芽腫患者臨床分離株經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)及分子生物學(xué)鑒

6、定為紅色毛癬菌。11株淺表感染患者臨床分離株經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)均鑒定為紅色毛癬菌。
　　(2)紅色毛癬菌溫度試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過隨機(jī)區(qū)組設(shè)計資料的方差分析，紅色毛癬菌肉芽腫株3株和標(biāo)準(zhǔn)株ATCC4438菌株和溫度都有差異(P＜0.05、P＜0.05)。14天、21天標(biāo)準(zhǔn)株ATCC4438在25℃、27℃培養(yǎng)條件下菌落直徑大于其在35℃、37℃培養(yǎng)條件下的菌落直徑，三株肉芽腫菌株在35℃、37℃、27℃三個溫度條件下菌落直徑均無差異(P＞0.05)

7、，39℃、41℃下肉芽腫株不生長。11株淺部感染分離株在27℃培養(yǎng)條件下菌落直徑均大于其在37℃培養(yǎng)條件下的菌落直徑(P＜0.05)。
　　(3)體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果肉芽腫株和淺部感染株對伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的MIC值均在正常范圍內(nèi)，無耐藥株出現(xiàn)。
　　(4)基因型分析結(jié)果TRS-1區(qū)根據(jù)條帶不同分為4型，NJT001、淺2、淺4、淺7、淺10為type1型;NJT002、ATCC4438、淺3、淺5、淺6、

8、淺9、淺11為type2型;淺1為type3型;NJT003、淺8為type4型。TRS-2區(qū)根據(jù)條帶不同可分為2型，肉芽腫株和標(biāo)準(zhǔn)株均在500bp處形成條帶，僅有淺5在400bp左右條帶。NJT001TRS-1區(qū)序列長441bp，與GenBank中紅色毛癬菌(AF222889)有1個堿基差異;TRS-2區(qū)序列長508bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有3個堿基差異。NJT002 TRS-1區(qū)序列長

9、605bp，與GenBank中紅色毛癬菌(AF222887)有16個堿基差異，TRS-2區(qū)序列長509bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有3個堿基差異。NJT003 TRS-1區(qū)序列長898bp，與GenBank中紅色毛癬菌(JX431933)有19個堿基差異，TRS-2區(qū)序列長508bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有2個堿基差異。
　　結(jié)論:紅色毛癬菌

10、肉芽腫株的鑒定需要病理學(xué)和分子生物學(xué)等才能明確鑒定。本文中紅色毛癬菌肉芽腫株較淺表感染分離株更耐熱，肉芽腫株和淺表分離株對伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的敏感性無差異，均未發(fā)生耐藥。肉芽腫株和淺表分離株基因分型無差異。3株肉芽腫菌株TRS-1區(qū)序列與GenBank中的紅色毛癬菌分別有1、3和19個堿基差異，TRS-2區(qū)序列與GenBank中的紅色毛癬菌分別有2-3個堿基差異，從而推測三例肉芽腫菌株可能是紅色毛癬菌的一個變種。

11、>　　第二部分：紅色毛癬菌感染BalB/C鼠肉芽腫模型的構(gòu)建
　　目的：紅色毛癬菌不僅引起皮膚淺部感染還可引起深部感染，但相關(guān)動物模型未見研究報道。本部分?jǐn)M構(gòu)建紅色毛癬菌感染的癬菌性肉芽腫模型。
　　方法：紅色毛癬菌肉芽腫分離株3株，來自2013年4月到2015年5月南京總醫(yī)院皮膚科門診的3位紅色毛癬菌肉芽腫患者組織，分離自體癬患者的體癬株2株，菌株均經(jīng)傳統(tǒng)方法的分離培養(yǎng)并經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，依次命名為NJT001-NJT00

12、3、淺1和淺2。紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCCMYA4438。
　　(1)普通級健康BalB/C小鼠52只，隨機(jī)分為13籠，4只小鼠置于1籠，編號為1-13。將13籠小鼠分為3組，第1組為空白對照組（為第1籠，不接種紅色毛癬菌）;第2組為PBS菌懸液組，第2-7籠，依次接種NJT001、NJT002、NJT003、淺1、淺2和ATCCMYA4438紅色毛癬菌PBS菌懸液。第3組為實(shí)驗(yàn)組，第8-13籠，依次接種NJT001、NJT002

13、、NJT003、淺1、淺2和ATCCMYA4438紅色毛癬菌黏液素菌懸液。
　　(2)除空白對照組外，接種前7d開始，每日1次給予地塞米松磷酸鈉注射液25mg.kg-1·d-1腹腔注射BalB/C鼠。將實(shí)驗(yàn)菌株制成無菌的PBS和無菌的黏液素溶液(5g/100ml)菌絲段（含分生孢子）懸液，在細(xì)胞計數(shù)板下調(diào)整菌絲段/孢子濃度為1×108/ml待用。
　　(3)接種時對小鼠足墊進(jìn)行常規(guī)消毒，用1ml注射器吸取上述菌懸液，向小鼠一

14、只足墊中注射0.2ml菌懸液，另一只作為陰性對照?？瞻讓φ战M注射0.2ml生理鹽水。
　　(4)各組動物給予地塞米松磷酸鈉注射液25 mg.kg-1·d-1腹腔注射，每天注射1次，共21次。每天觀察實(shí)驗(yàn)動物接種處皮膚腫脹破潰變化。接種后第21天處死動物，取接種處皮膚膿液涂片進(jìn)行直接鏡檢，同時將病變組織接種于含氯霉素和放線菌酮的PDA培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱27℃下培養(yǎng)。動物處死后，剪取接種處全層皮膚組織，中性甲醛固定，石蠟包埋切片，分別

15、行HE染色和PAS染色。
　　結(jié)果：(1)大體變化空白組、PBS菌懸液組和實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后足墊注射菌懸液后出現(xiàn)腫脹，一周后腫脹逐漸消退，兩周后腫脹完全消退，與陰性對照無異。實(shí)驗(yàn)組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠足墊注射菌懸液后出現(xiàn)腫脹，腫脹持續(xù)不消退，接種后第15天開始，小鼠足墊出現(xiàn)破潰和膿腫。直至動物處死，膿腫和破潰持續(xù)存在，無愈合傾向。
　　(2)直接鏡檢結(jié)果直接鏡檢可見實(shí)

16、驗(yàn)組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠足墊膿液中存在細(xì)長菌絲，而空白組、PBS菌懸液組和實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠足墊接種處均沒有膿液，故取組織加等滲鹽水研磨后進(jìn)行直接鏡檢，均未見菌絲和孢子。
　　(3)組織培養(yǎng)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠組織接種平板培養(yǎng)7天后，可見菌落生長，且與接種前菌落形態(tài)基本相同。小培養(yǎng)及分子生物學(xué)鑒定證實(shí)與接種菌株相同。而空白組、PB

17、S菌懸液組和實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠組織培養(yǎng)21d后均未見真菌生長。
　　(4)組織病理結(jié)果HE染色下空白組、PBS菌懸液組、實(shí)驗(yàn)組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠足部組織未見肉芽腫組織形成，實(shí)驗(yàn)組NJT001、NJT002和NJT003處理后小鼠足部組織可見表皮角化過度，真皮內(nèi)肉芽腫形成，內(nèi)含中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量炎細(xì)胞浸潤，同時還可見大片壞死區(qū)域。PAS染色下空白組、PBS菌懸液組和實(shí)