反硝化菌DNF409水體脫氮規(guī)律研究及其narG基因的中斷.pdf

1、養(yǎng)殖水環(huán)境的日趨惡化已成為制約我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素，其中亞硝酸鹽污染已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常見(jiàn)且難以預(yù)防的危害因素之一。生物反硝化法是理論上解決水體氮污染的有效方法。 本研究的目的是通過(guò)系統(tǒng)研究反硝化菌DNF409的反硝化特性及在天然養(yǎng)殖水體中的脫氮規(guī)律，獲得用以指導(dǎo)其實(shí)際應(yīng)用的各項(xiàng)參數(shù)；并采用基因打靶技術(shù)中斷該菌株硝酸鹽還原酶的結(jié)構(gòu)基因narG基因，以改善其反硝化特性。具體研究結(jié)果如下： 1．通過(guò)生理生化和16S r

2、DNA序列分析，反硝化菌DNF409初步判斷為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。生長(zhǎng)的最適pH為6～7，反硝化作用的最適pH為7～8。在生長(zhǎng)的各個(gè)階段，菌株DNF409均具有較強(qiáng)的反硝化活性，最佳反硝化碳源為乙醇。 2．菌株DNF409可在天然養(yǎng)殖水體中高效進(jìn)行反硝化作用。研究表明，28℃～30℃，當(dāng)水體C／N（質(zhì)量比）大于等于8.0:1，菌體濃度達(dá)到10<'8>cfu／L肘，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的降解率可分別達(dá)到94.79％

3、和99.94％。表明該菌株在養(yǎng)殖水體的生物脫氮方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 3．利用E.coli與Bacillus sp.的穿梭質(zhì)粒pEG491，構(gòu)建了narG基因中斷載體pEGude。該質(zhì)粒帶有一個(gè)溫度敏感型的復(fù)制子，并攜帶有兩個(gè)長(zhǎng)度分別為1.1 Kb、2.1 Kb且與narG基因序列方向完全相同的同源臂，在同源臂之間及載體部分別含有可在菌株DNF409中表達(dá)的抗性基因erm、cat。 4．將基因中斷載體pEGude電激轉(zhuǎn)

4、化至反硝化菌DNF409中，通過(guò)抗性篩選得到表型為：Erm<'r>Cm<'s>的重組子DNF409EF，并通過(guò)PCR分析證實(shí)narG基因已被正確中斷。 5．對(duì)基因中斷菌株DNF409EF進(jìn)行反硝化能力檢測(cè)，結(jié)果表明該菌株并未失去對(duì)硝酸鹽的還原能力。但它對(duì)硝酸鹽及亞硝酸鹽的還原作用與菌株DNF409相比，均出現(xiàn)了一定程度的延后現(xiàn)象，初步說(shuō)明硝酸鹽的異化還原對(duì)亞硝酸鹽的異化還原存在一定的影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不符，具體原因有待進(jìn)