不同級別腦膠質(zhì)瘤中差異microRNA的表達(dá)譜研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50％-60％。腫瘤具有浸潤性生長、易復(fù)發(fā)、侵襲性強(qiáng)、血管豐富等惡性生物學(xué)特征，患者預(yù)后較差，平均生存期較短。隨著表觀遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，大量研究從分子水平和細(xì)胞水平揭示膠質(zhì)瘤進(jìn)展的機(jī)制。MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA(約22nt)，通過與靶基因非完全互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的許多腫瘤中，都觀察到miRNA的表達(dá)異

2、常，并影響細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、血管生成等重要的生物學(xué)過程。目前大量的研究集中在膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中miRNA的異常及其發(fā)揮的作用，對級別特異的miRNA表達(dá)譜研究較少。本研究采用miRNA芯片技術(shù)，通過對比腫瘤及配對的瘤周組織，篩選出不同級別腦膠質(zhì)瘤中差異miRNA分子的表達(dá)譜，為尋找腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用及不同級別間特異的miRNA分子提供參考。異檸檬酸脫氫酶1(Isocitrate dehydrogenases1，IDH1)

3、突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化在膠質(zhì)瘤中普遍存在，和患者預(yù)后關(guān)系密切。有研究報(bào)道:IDH1基因突變的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的組蛋白甲基化程度更高;IDH1和MGMT聯(lián)合能更好的預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后。IDH1和MGMT在腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過程中是否受miRNA調(diào)控從而形成內(nèi)在關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步探討二者之間的關(guān)聯(lián)性及其可能的機(jī)制，將為膠質(zhì)瘤患者的診治提供更多理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　第一部分:收集臨床腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，提取組織總RNA，利用miRNA

4、芯片篩選出腦膠質(zhì)瘤和配對瘤周組織中差異表達(dá)的miRNA分子。qRT-PCR驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果的可靠性。生物信息學(xué)軟件預(yù)測這些miRNA潛在的靶基因。
　　第二部分:直接測序法檢測腦膠質(zhì)瘤樣本中IDH1突變情況。
　　第三部分:nMSP法和MSP-DHPLC法檢測膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因突變的情況。
　　第四部分:卡方檢驗(yàn)分析IDH1基因突變和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　1.腦膠質(zhì)

5、瘤中差異miRNA的表達(dá)譜分析
　　(1) MiRNA芯片技術(shù)是一種高效可靠的高通量分析腦膠質(zhì)瘤差異miRNA表達(dá)譜的方法
　　(2)通過9例膠質(zhì)瘤組織和與之配對的瘤周組織對比，利用miRNA芯片分析了1926個(gè)miRNA分子。共篩選出13個(gè)具有明顯差異表達(dá)的miRNA分子，其中表達(dá)水平上調(diào)的miRNA分子12個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的1個(gè)。
　　(3)在WHOⅡ、WHOⅢ、WHOⅣ級腦膠質(zhì)瘤中分別有8、9、15個(gè)miRNA分

6、子表達(dá)異常。
　　(4)首次發(fā)現(xiàn)miR-4489在腦膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，miR-4489可能在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
　　(5)腦膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中，miR-106b-25 cluster可能作為miR-17-92 cluster的輔助，提高腫瘤的惡性程度。
　　(6)利用生物信息學(xué)軟件對13個(gè)差異表達(dá)的miRNA分子的靶基因進(jìn)行預(yù)測，共找到926個(gè)潛在的靶基因。這些基因主要富集在與神經(jīng)系統(tǒng)和腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程和信號(hào)通路

7、上。
　　2.腦膠質(zhì)瘤中IDH1基因突變檢測與分析
　　(1)46.62％(62/133)的膠質(zhì)瘤患者檢測出IDH1基因突變。突變主要發(fā)生于WHOⅡ級、WHOⅢ級膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
　　(2)膠質(zhì)瘤患者IDH1突變和患者年齡顯著相關(guān)(p=0.001)，兩者的相關(guān)度為R=0.296。
　　3.腦膠質(zhì)瘤中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化表達(dá)研究
　　(1)經(jīng)nMSP法檢測，66.33％(65/98)的腦膠質(zhì)瘤

8、組織中發(fā)生MGMT基因啟動(dòng)子甲基化。經(jīng)MSP-DHPLC法檢測，65.71％(23/35)的腦膠質(zhì)瘤組織中發(fā)生MGMT基因啟動(dòng)子甲基化。
　　(2)四格表X檢驗(yàn)比較nMSP和MSP-DHPLC法檢出率的一致性，兩種方法檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=0.004，P=0.948)。
　　(3) Spearman等級相關(guān)分析提示:MGMT啟動(dòng)子甲基化和腦膠質(zhì)瘤病理級別的相關(guān)性不顯著(p＞0.05)，與患者年齡也無明顯相關(guān)性(p=0

9、.654)
　　4.IDH1突變與MGMT基因啟動(dòng)子甲基化關(guān)聯(lián)性分析:
　　(1)X檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析提示:IDH1突變與MGMT基因啟動(dòng)子甲基化關(guān)聯(lián)顯著(X2=6.57，P=0.01)，列聯(lián)系數(shù)C=0.217，二者低度相關(guān)。
　　(2)926個(gè)潛在的靶基因中，不包括MGMT和IDH1。提示篩選出的13個(gè)差異表達(dá)的miRNA不直接調(diào)控MGMT和IDH1的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，本文研究表明:1.M

10、iRNA芯片技術(shù)是腦膠質(zhì)瘤中尋找分子標(biāo)記的可靠方法。2.利用miRNA芯片篩選出不同級別腦膠質(zhì)瘤中差異miRNA的表達(dá)譜，為進(jìn)一步尋找級別特異和腫瘤惡性進(jìn)展中重要的miRNA提供了重要參考。3.本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-4489在腦膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，其在腫瘤中的作用有待進(jìn)一步研究。4.IDH1突變和MGMT啟動(dòng)子甲基化存在著關(guān)聯(lián)性，二者在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能存在調(diào)控關(guān)系。5.篩選出的miRNA并不直接調(diào)控MGMT和IDH1基因，這些miRN