急性移植物抗宿主病狀態(tài)下血小板減少機制的研究.pdf

1、研究目的：
　　異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic stem cell transplatation，allo-HSCT)后部分患者出現(xiàn)一系或多系血細(xì)胞減少，臨床上以紅系、巨核系減少為主，多見于Ⅱ°以上急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD），巨細(xì)胞病毒感染，更昔洛韋類抗病毒藥物使用等情況。持續(xù)性血細(xì)胞減少提示患者預(yù)后不良，是移植相關(guān)并發(fā)癥或死亡的重要原因之一。目前關(guān)

2、于移植后造血功能不良的機制尚不十分清楚，治療手段有限。本研究主要納入接受allo-HSCT的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，動態(tài)觀察移植前后各時間點白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白、血小板計數(shù)水平、骨髓和外周血細(xì)胞因子的動態(tài)變化，分析造血功能不良特別是持續(xù)性血小板減少患者的臨床特征及相關(guān)危險因素。利用骨髓體外集落培養(yǎng)、多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析各類造血干、祖細(xì)胞增殖情況，探究異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后造血功能異常、尤其是血小板減少的機制，為臨床治療提供新策略

3、。
　　研究方法：
　　移植后血小板減少患者的臨床特征分析2015年8月至2017年2月接受allo-HSCT的病歷資料完整且移植后無復(fù)發(fā)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者56人，動態(tài)觀察其移植前（-7天），移植后15天、30天、60天、90天、180天、270天、360天的外周血三系計數(shù)變化，根據(jù)有無aGVHD及血小板減少(Thrombocytopenia，TP)發(fā)生分為3組:1）aGVHD/TP組:移植后+30天內(nèi)造血重建成功，其后

4、發(fā)生Ⅱ°以上aGVHD，而后出現(xiàn)持續(xù)性血小板減少(＜20×109/L)7天以上，骨髓巨核增生低下，仍需輸注血制品支持;2）造血良好組:移植后+30天內(nèi)造血重建成功，血象穩(wěn)定并逐漸恢復(fù)至正常水平(＞90×109/L)，未發(fā)生Ⅱ°以上aGVHD;3）造血不良組:移植后無aGVHD表現(xiàn)，血小板重建緩慢，+90天內(nèi)血小板計數(shù)持續(xù)＜90×109/L;另選取健康供體作為對照組。骨髓體外集落培養(yǎng)(CFU)將上述時間點骨髓，體外分離獲取單個核細(xì)胞，進行

5、體外集落培養(yǎng)，包括粒細(xì)胞集落形成單位(CFU-G)、巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-M)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)、混合細(xì)胞集落形成單位(CFU-Mix)、紅細(xì)胞集落形成單位(CFU-E)、爆式紅細(xì)胞集落形成單位(BFU-E)、巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU-Mk)，每組6個復(fù)孔，12-14天后顯微鏡下計數(shù)集落。骨髓微環(huán)境的變化將上述時間點骨髓，體外分離純化為單個核細(xì)胞，取1×106單個核細(xì)胞標(biāo)記單克隆抗體，應(yīng)用多參數(shù)流式

6、細(xì)胞術(shù)檢測造血干/祖細(xì)胞(CD34+)、造血干細(xì)胞(CD34+CD38-)、造血祖細(xì)胞(CD34+CD38+)、髓系祖細(xì)胞（CD34+CD38+CD135+CD10-）、巨核系-紅系定向祖細(xì)胞(CD34+CD38+CD135-CD10-)細(xì)胞群;骨髓內(nèi)皮細(xì)胞(CD45CD34+CD309+)、管周細(xì)胞(CD45-CD34CD146+)和骨髓巨核細(xì)胞(CD41+);CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、Th1(C

7、D3+CD4+IFN-r+)、Th2(CD3+CD4+IL-17+)、Th17（CD3+CD4+IL-17+）、Treg(CD3+CD4+CD25+FoxP3+)。統(tǒng)計學(xué)分析分析3組外周血三系恢復(fù)情況及與aGVHD的關(guān)系，采用IBM SPSS Statistics20、Graphpad Prism5統(tǒng)計分析，利用Kaplan-Meier生存曲線分析總體生存，Log-rank對生存差異進行比較。
　　研究結(jié)果：
　　1、移植后

8、100天內(nèi)發(fā)生臨床Ⅱ°以上aGVHD13例，其中aGVHD/TP組共10例。按照移植后100天內(nèi)aGVHD及并發(fā)血小板減少的情況將病人分為:aGVHD/TP17.86％(10/56)，造血良好組為66.07％(37/56)，造血不良組為16.07％(9/56)。中位aGVHD發(fā)生時間為52(24-92)天，aGVHD/TP組較造血良好組總體生存明顯減低(P＜0.0001)。aGVHD/TP組移植后血小板計數(shù)較造血良好組明顯減低，同時伴血

9、紅蛋白計數(shù)下降，中性粒細(xì)胞計數(shù)無明顯下降。骨髓形態(tài)學(xué)檢查示:aGVHD/TP組中巨核細(xì)胞數(shù)量在aGVHD發(fā)生后減少，伴巨核細(xì)胞呈小圓巨核發(fā)育異常，產(chǎn)板減少，aGVHD/TP組與造血不良組巨核細(xì)胞數(shù)量無顯著統(tǒng)計學(xué)差異;aGVHD/TP患者外周血中IL-2R在aGVHD發(fā)生時明顯增高，且與血小板計數(shù)呈相反變化趨勢。
　　2、與正常供者來源骨髓相比，allo-HSCT后患者集落形成能力減低，以巨核系紅系祖細(xì)胞(MEP)階段為主，+60天

10、后緩慢恢復(fù)至與正常供體相似;aGVHD/TP組較造血不良組各系CFU頻率減低，但組間差異上無明顯統(tǒng)計學(xué)意義;aGVHD/TP組各系造血細(xì)胞CFU頻率較造血良好組明顯下降，在移植后+90天組間差異明顯;且巨核細(xì)胞呈現(xiàn)分化發(fā)育異常。
　　3、造血良好組HSC/HPC的比例是波動變化的，整體水平高于aGVHD/TP組及造血不良組，在移植后1年內(nèi)造血良好組HSC/HPC比例尚未完全恢復(fù)正常;其HSC、HPC、MEP均低于正常對照組，且ME

11、P較其他細(xì)胞群恢復(fù)慢。aGVHD/TP組骨髓造血干/祖細(xì)胞及下游祖細(xì)胞相對比例均較造血良好組減低，在移植+30天以后差異明顯，主要表現(xiàn)在HPC、CMP及MEP細(xì)胞群。
　　4、在移植后15天至180天，aGVHD/TP組骨髓內(nèi)皮與造血良好組相比，aGVHD/TP組與正常對照組相比均無顯著差異;aGVHD發(fā)生后，aGVHD/TP組管周細(xì)胞及巨核祖細(xì)胞數(shù)目較其他兩組明顯減低。
　　5、aGVHD/TP組Th1細(xì)胞群較造血良好組增

12、高，造血不良組與造血良好組變化相似。
　　研究結(jié)論：
　　1、Allo-HSCT后患者多存在血紅蛋白及血小板恢復(fù)遲緩，aGVHD/TP患者血小板計數(shù)較造血良好組明顯減低，同時骨髓形態(tài)中巨核細(xì)胞比例明顯下降，從各種細(xì)胞的恢復(fù)趨勢看，造血不良組不同于aGVHD/TP組，造血最終能緩慢恢復(fù)。
　　2、Allo-HSCT后患者各系集落形成能力減低，以CFU-E/BFU-E及CFU-Mk為主，aGVHD/TP組紅系及巨核系集落除

13、了數(shù)量上更明顯的下降外，培養(yǎng)的巨核細(xì)胞呈現(xiàn)小圓巨核形態(tài)異常，產(chǎn)板減少，可能與aGVHD對造血細(xì)胞的二次打擊有關(guān)。
　　3、Allo-HSCT后流式檢測骨髓造血細(xì)胞比例下降，以HSC/HPC及MEP為主，造血良好組HSC/HPC比例在移植后1年尚未完全恢復(fù)至正常，提示allo-HSCT使造血系統(tǒng)受損。而aGVHD/TP組各群造血細(xì)胞比例下降更為明顯，提示aGVHD環(huán)境下干/祖細(xì)胞群造血抑制程度加深。
　　4、aGVHD/TP組