傳統(tǒng)藏藥材川西獐牙菜減輕肝臟膽汁淤積損傷的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　膽汁淤積(Cholestasis)是由多種肝臟疾病引起的臨床綜合癥，常與原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、Dubin-Johnson綜合癥等相伴。肝炎、藥物中毒、梗阻、妊娠等均可引起膽汁淤積。就分子水平而言，膽汁淤積的發(fā)生主要與位于肝細(xì)胞表面的膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR1（多藥耐藥蛋白1，Multidrug resistance protein1）、MDR2(多藥耐藥蛋白2，Multidrug resistance pr

2、otein2)、MRP2(多要耐藥相關(guān)蛋白2，Multidrugresistance-associated protein2)、MRP3(多藥耐藥相關(guān)蛋白3，Multidrugresistance-associated protein3)、MRP4(多要耐藥相關(guān)蛋白4，Multidrugresistance-associated protein4)等的表達(dá)異常相關(guān)。其中，MRP3、MRP4位于肝細(xì)胞基底側(cè)膜，主要負(fù)責(zé)將有機(jī)陰離子、膽紅素

3、、藥物等由肝細(xì)胞排入血液，而MRP2、MDR1、MDR2等則位于肝細(xì)胞膽管膜面，主要將一些內(nèi)源性或外源性的結(jié)合產(chǎn)物排入膽管。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，膽汁淤積發(fā)生后，位于肝細(xì)胞膽管膜面的MRP2表達(dá)下降，而位于肝細(xì)胞基底側(cè)膜的MRP3、MRP4的表達(dá)則增高，以代償MRP2的部分功能。目前，臨床治療膽汁淤積主要依靠FXR的激動(dòng)劑UDCA，但是UDCA并不適用于所有人群，此外，還有利福平、苯巴比妥等，但其都具有自身局限性，而正在開發(fā)的新藥GW4064和

4、TNT747目前還處于臨床試驗(yàn)階段。因此，臨床亟需研發(fā)新的更有效的藥物。
　　川西獐牙菜為我國(guó)藏藥八寶——“藏茵陳”的主要原生植物之一，常年生長(zhǎng)于海拔2000-5000米的青藏高原，其主要有效成分為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸、芒果苷、苦龍膽苷、當(dāng)藥醇苷等，具有清肝利膽，祛熱退黃之功效，尤其適用于黃疸型肝炎、病毒性肝炎，是我國(guó)治療各種肝病的傳統(tǒng)藥材[7-9]。但其清肝利膽的具體分子機(jī)制并不明確，加之成分復(fù)雜多樣，因此難以被國(guó)際醫(yī)

5、學(xué)界接受。臨床治療膽汁淤積的常用藥物“尤思弗”其主要成分為UDCA，即是從熊膽汁中提取出的有效成分，而我國(guó)古代便有使用熊膽汁治療各種肝病的傳統(tǒng)。受“尤思弗”發(fā)現(xiàn)、研究、推廣的啟發(fā)，我們對(duì)治療各種肝病，具有“清肝利膽”作用的藏藥“藏茵陳”進(jìn)行研究，提取其主要原生植物——川西獐牙菜的醇提物，用以干預(yù)膽汁淤積的動(dòng)物模型，以期能夠發(fā)現(xiàn)新的治療膽汁淤積的有效藥物，彌補(bǔ)UCDA的不足，同時(shí)也為保護(hù)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥，維護(hù)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)做出貢獻(xiàn)。
　　

6、方法：
　　1.建立膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型，并對(duì)其進(jìn)行藥物干預(yù)，膽汁淤積模型的建立見參考文獻(xiàn)。將15只SD大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組:(1)川西獐牙菜醇提物組、(2)UDCA組、(3)生理鹽水組，每組5只。分別用川西獐牙菜醇提物、UDCA、生理鹽水連續(xù)灌胃7d，7d后處死大鼠，收集血液、尿液及肝臟組織。血清學(xué)檢測(cè)肝損傷指標(biāo)和黃疸指標(biāo)，HE染色觀察肝臟損傷情況，以明確川西獐牙菜對(duì)膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型是否具有保護(hù)作用。

7、r>　　2.藥物干預(yù)正常大鼠:使用隨機(jī)數(shù)字表法將10只正常雄性SD大鼠分為2組:(1)川西獐牙菜醇提物組、(2)生理鹽水組，每組5只。分別用川西獐牙菜醇提物和生理鹽水連續(xù)灌胃7d，7d后處死大鼠收集肝臟組織。提取大鼠肝臟RNA和總蛋白，分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)肝細(xì)胞膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp3、Mrp4、Mrp2、Mdr1、Mdr2、Ostα、Ostβ的表達(dá)變化和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、Lrh-1及核受體Rxrα、Rarα、Vdr、Pxr、

8、Car等的表達(dá)變化，最后分析其相關(guān)性，尋找川西獐牙菜醇提物對(duì)膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型保護(hù)作用的可能分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.藥物干預(yù)膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型:分別用100mg/kg body w.t.的川西獐牙菜醇提物、UDCA（陽(yáng)性對(duì)照）、生理鹽水（陰性對(duì)照）連續(xù)灌胃大鼠7d，收集標(biāo)本，血清學(xué)結(jié)果顯示:與生理鹽水組相比，川西獐牙菜組和UDCA組的肝損傷指標(biāo)和黃疸指標(biāo)明顯低于生理鹽水組，且川西獐牙菜組的各項(xiàng)指標(biāo)較U

9、DCA組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H.E.染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)川西獐牙菜組大鼠肝臟損傷情況明顯輕于UDCA組和生理鹽水組。
　　2.藥物干預(yù)正常大鼠:以生理鹽水為陰性對(duì)照，100mg/kg body w.t.的川西獐牙菜醇提物連續(xù)灌胃大鼠7d，收集大鼠肝臟組織標(biāo)本后提取RNA和蛋白，利用RT-qPCR和Westem Blot技術(shù)分別檢測(cè)肝臟膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp2、Mrp3、Mrp4、Mdr1、Mdr2等和核受體Pxr、Rxrα、Rarα、V

10、dr以及核轉(zhuǎn)錄因子Lrh-1、Nrf2等的表達(dá)變化，結(jié)果顯示:
　　(1)膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:在mRNA水平，與陰性對(duì)照組相較，Mrp4、Mrp3表達(dá)上升明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:Mrp4的表達(dá)增高了2.1倍，Mrp3的表達(dá)增高了1.7倍，結(jié)果顯著，具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在蛋白水平，川西獐牙菜組Mrp4、Mrp3表達(dá)亦增高，其中Mrp4表達(dá)增高2.5倍，Mrp3表達(dá)增高3.0倍，結(jié)果顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Mdr1、Mdr2、Rxrα、Rarα、

11、Vdr等無(wú)明顯變化。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果也顯示，川西獐牙菜醇提物組其樣本Mrp4、Mrp3的表達(dá)明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照組。
　　(2)核受體和核轉(zhuǎn)錄因子:在mRNA水平，相比于陰性對(duì)照組，川西獐牙菜醇提物組Nrf2表達(dá)增高1.8倍，Lrh-1表達(dá)增高1.4倍;同時(shí)，在蛋白水平，與陰性對(duì)照組相比，川西獐牙菜醇提物組Nrf2表達(dá)增高2.3倍，Lrh-1表達(dá)增高1.3倍，Pxr表達(dá)增高1.8倍，Vdr表達(dá)增高1.8倍，結(jié)果顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

12、
　　(3)膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與核受體和核轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性分析:由于在mRNA水平和蛋白水平均發(fā)現(xiàn):相較于陰性對(duì)照組，川西獐牙菜醇提物組肝細(xì)胞表面膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp4、Mrp3和核受體Lrh-1、核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)增高，通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn):川西獐牙菜可能通過Nrf2刺激Mrp4使其表達(dá)增高，而與Mrp3無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論：
　　(1)與生理鹽水組相比，川西獐牙菜醇提物和UDCA均具有減輕肝損傷的作用，且川西獐牙菜醇提物