栝樓抗腫瘤活性蛋白的分離純化及誘導大腸癌細胞凋亡的機制研究.pdf

1、大腸癌（CRC）是常見的消化道惡性腫瘤。盡管在過去幾十年中，大腸癌治療已經有了相當大的進步，但是大腸癌的死亡率仍然很高。在世界范圍內，大腸癌是癌癥死亡的主要原因之一。目前化療是治療大腸癌最常用的方法之一，然而，許多化療藥物對人體有極大的毒副作用，從而限制了其臨床的應用。許多研究報道植物來源的抗腫瘤活性蛋白具有低毒和低副作用的優(yōu)點，是一種極具潛力的抗腫瘤藥物。栝樓（Trichosanthes kirilowii）是葫蘆科栝樓屬的一種多年生

2、纏繞性藤本植物。在中國，栝樓種子是一種可以食用的受歡迎的小吃，而且在古代東方已經廣泛作為民間藥物，是歷史悠久的常用中藥材。栝樓中的許多生物活性成分：石榴酸、三萜類化合物等已經被報道具有良好的調節(jié)脂類代謝，抵制炎癥及降低葡萄糖的活性等功能。已有報道栝樓煎劑在體外有抑制癌細胞增殖的活性且其抑制效果與劑量存在正相關。栝樓根來源的天花粉蛋白也被報道具有抗腫瘤活性。但是關于栝樓果實的的抗腫瘤活性成分報道較少。本研究擬從栝樓果實中分離純化出一種抗腫

3、瘤活性蛋白，并對其誘導大腸癌細胞凋亡的機制進行研究。主要研究內容包括以下幾部分：
　　第一部分采用磷酸鹽緩沖液抽提、丙酮沉淀、飽和硫酸銨沉淀，Q-陰離子層析，S-200凝膠層析并結合細胞存活實驗（MTT法），從栝樓果實中分離純化得到單一的抗腫瘤活性蛋白，將其命名為TKP。質譜鑒定結果顯示，TKP與羅漢果屬黃瓜素同源性較高，其分子質量約為46 kD。進一步對TKP進行了酶活性鑒定，結果顯示，PMSF（絲氨酸蛋白酶抑制劑）明顯抑制了T

4、KP的酶活性，表明TKP是一種絲氨酸蛋白酶。
　　第二部分用TKP分別處理大腸癌細胞（DLD1、HCT116、和SW620）和腸正常細胞（NCM460），檢測TKP對大腸癌細胞增殖的影響。MTT實驗結果顯示，TKP明顯的抑制了大腸癌細胞生存活力，但對腸正常細胞的生存活性沒有明顯的影響；克隆形成實驗結果顯示，TKP抑制了大腸癌細胞的增殖。DAPI染色和流式細胞術檢測結果顯示，TKP明顯誘導大腸癌細胞凋亡。JC-1染色結果顯示，TKP

5、引起了大腸癌細胞線粒體膜電位的降低。Western印跡結果顯示， TKP處理大腸癌細胞后， Cytochrome c、Bax、Activated-caspase-9和Activated-caspase-3的蛋白水平明顯上調， Bcl-2的蛋白水平明顯下調。上述結果表明，TKP誘導的大腸癌細胞凋亡是通過線粒體凋亡途徑。
　　第三部分用TKP處理大腸癌細胞，檢測其對MAPK和PI3K/AKT信號通路的影響。Western印跡結果表明T

6、KP處理提高了p-ERK1/2的蛋白水平，但是對p-JNK和p-p38沒有明顯的影響。同時，我們發(fā)現TKP處理降低了p-AKT的蛋白水平，對AKT的表達沒有明顯影響。這些結果表明，TKP處理激活MAPK/ERK1/2信號通路并抑制PI3K/AKT信號通路。為了揭示MAPK/ERK1/2信號通路在TKP誘導大腸癌細胞凋亡中的作用，用MAPK/ERK1/2信號通路抑制劑PD98059處理細胞，結果發(fā)現，PD98059明顯抑制TKP對ERK1

7、/2磷酸化的誘導，但是進一步加強了TKP誘導的細胞凋亡。這些結果表明，MAPK/ERK1/2信號通路不參與TKP誘導的大腸癌細胞凋亡。進一步用 PI3K/AKT信號通路抑制劑 LY294002和激活劑 IGF-1檢測PI3K/AKT信號通路的作用，結果發(fā)現，LY294002進一步降低了TKP誘導的p-AKT蛋白水平的下調，增強了TKP誘導的Cytochrome c、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白水平的上調和Bcl-2

8、蛋白水平的下調。與此相一致，LY294002加劇TKP誘導的細胞活力的降低、細胞凋亡及線粒體膜電位的降低。激活劑IGF-1處理后，TKP誘導的細胞活力降低和凋亡被抑制。以上結果表明，TKP通過PI3K/AKT信號通路誘導大腸癌細胞凋亡。
　　綜上所述，本研究從栝樓果實中分離純化得到單一抗腫瘤活性蛋白TKP。TKP能明顯抑制大腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，機制研究發(fā)現TKP通過PI3K/AKT信號通路介導的線粒體依賴的凋亡途徑誘導大腸