敲低TRIM11對結腸癌細胞HT29增殖及凋亡影響的研究.pdf

1、目的：
　　應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建TRIM11基因穩(wěn)定、永久性敲低的人結腸癌HT29細胞，探討TRIM11基因敲低對HT29細胞生長及5-FU藥物敏感性的影響，為臨床結腸癌治療尋找新靶點。
　　方法：
　　1.收集經組織學或細胞學證實的結腸癌患者術后新鮮癌組織及癌旁正常組織標本，采用qRT-PCR檢測TRIM11在結腸癌組織與癌旁正常組織中的表達差異。
　　2.設計并合成靶向TRIM11基因的sgRN

2、A,連接至LentiCRISPRv2載體，經測序驗證后將重組質粒導入病毒包裝細胞293T中，收集病毒上清轉染結腸癌細胞HT29，應用WesternBlot測定轉染后HT29細胞中TRIM11蛋白表達量，獲得TRIM11敲低的HT29-KD細胞株。
　　3.用CCK-8法檢測HT29-KD細胞及HT29細胞5天增殖變化，分析TRIM11低表達對HT29細胞增殖的影響。
　　4.應用克隆形成實驗比較HT29-KD細胞及HT29細

3、胞克隆形成能力差異，分析TRIM11敲低對腸癌細胞HT29克隆形成能力的影響。
　　5.5-FU誘導HT29-KD細胞及HT29細胞凋亡，24h后行流式細胞術檢測細胞凋亡情況，分析TRIM11低表達對化療藥物5-FU誘導HT29細胞凋亡的影響。
　　結果：
　　1.根據入排標準，收集到術后新鮮癌組織及對應的癌旁正常組織標本各23例。qRT-PCR結果顯示：在獲得的23對組織中，有20對組織的腫瘤組織TRIM11表達明顯

4、高于對應的癌旁正常組織，經配對t檢驗P<0.05(n>3)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.成功獲得3種LentiCRISPRv2-sgRNA重組質粒，測序結果顯示sgRNA插入質粒DNA的位置、方向及序列與預期相符；將經3種慢病毒（含LentiCRISPRv2-sgRNA重組質粒）轉染的HT29細胞行WesternBlot鑒定，發(fā)現3種細胞出現不同程度的TRIM11蛋白表達下調，其中敲除片段2的細胞幾乎不表達TRIM11蛋白。

5、>　　3.CCK-8增殖檢測結果顯示：細胞培養(yǎng)至第4、5天時HT29細胞增殖率分別為(891±120)％和（1999±100）%，HT29-KD細胞增殖率分別為（559±58）%和（1200±68）%，經配對t檢驗P<0.01(n>3)，差異有統(tǒng)計學意義，說明敲低TRIM11抑制HT29細胞增殖。
　　4.克隆形成實驗結果顯示：與HT29細胞克隆形成率為100%的對照組相比，HT29-KD細胞克隆形成率為（25±12.51）%，經

6、兩樣本t檢驗P<0.05(n>3)，差異有統(tǒng)計學意義，表明敲低TRIM11抑制HT29細胞克隆形成。
　　5.流式細胞術結果顯示：5-FU誘導細胞凋亡后，HT29-KD細胞早期凋亡率為（5.43±0.12）%，高于對照組HT29細胞早期凋亡率（4.17±0.31）%，經兩樣本t檢驗P﹤0.05(n>3)，差異有統(tǒng)計學意義，表明敲低TRIM11促進化療藥物5-FU誘導HT29細胞凋亡。
　　結論：
　　1.成功構建TRI