原發(fā)性肝癌中B7-H4的高表達對T細胞免疫抑制的研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中高居第3位，具有發(fā)病隱匿、進展迅速、治療困難、死亡率高等特點，成為世界范圍內惡性腫瘤高發(fā)病率和死亡率的主要因素，當前治療原發(fā)性肝癌的方式主要是以手術切除為主，結合術前或術后放化療，微創(chuàng)治療及生物治療的模式。隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展及對腫瘤研究的不斷深入，惡性腫瘤的免疫靶向治療方式成為目前研究的熱點，其中T細胞免疫和B7

2、家族中負性共刺激分子 B7-H4在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中的免疫應答越來越受到重視。
　　在腫瘤免疫應答過程中T細胞介導的細胞免疫起關鍵作用，T淋巴細胞活化及抗原特異性 T細胞免疫應答的產(chǎn)生及維持至少需要2個信號：第一信號由位于抗原提呈細胞(APC)上的抗原肽-組織相容性抗原（MHC）與T細胞表面的受體（TCR）相互識別作用產(chǎn)生；第二信號由位于APC上的刺激分子與T細胞上相對應的受體結合產(chǎn)生，又稱協(xié)同共刺激信號。共刺激信號傳導途徑一

3、方面增強 T細胞免疫應答過程中的正性第二信號，另一方面下調 T細胞免疫應答過程中的負性第二信號，在缺少TCR第二信號的情況下，會導致T淋巴細胞克隆無能或抑制T淋巴細胞的活化與功能,最終導致免疫抑制及免疫逃逸。負性共刺激分子 B7-H4屬于B7免疫球蛋白超家族，目前研究表明在腫瘤中B7-H4對T細胞免疫應答具有顯著的負性調節(jié)作用，目前是腫瘤免疫治療的研究熱點。
　　對于該課題，我們課題組前期已經(jīng)作了一些相關研究并取得一定成果：（1）

4、采用免疫熒光技術對80例人原發(fā)性肝癌和癌旁組織，20例正常肝組織中B7-H4的表達進行相關檢測。統(tǒng)計學分析結果表明:人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4的表達顯著高于肝癌旁組織和正常肝組織。（2）采用熒光免疫組化染色檢測80例人肝癌組織中B7-H4的表達與CD4+T、CD8+T細胞浸潤程度及功能性細胞因子TGF-β1、IFN-γ分泌相關性。統(tǒng)計學分析結果表明：人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4的表達水平與肝癌內CD4+T。CD8+T淋巴細胞浸潤程度，

5、功能性細胞因子TGF-β1和IFN-γ分泌均呈負相關。（3）采用Western Blot技術檢測人原發(fā)性肝癌及癌旁組織中純化分離出CD8+T細胞中B7-H4，IFN-γ及自噬上游信號通路PI3K-AKT-mTOR相關蛋白的表達情況。結果表明：與癌旁組織相比，肝癌組織純化分離出CD8+T細胞中B7-H4表達明顯上調，細胞因子 IFN-γ表達明顯下降； CD8+T細胞中P-AKT/AKT,P-mTOR/mTOR比值上升。提示原發(fā)性肝癌組織

6、CD8+T中 B7-H4表達上調可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路促進CD8+T細胞發(fā)生異常自噬。
　　結合前期實驗結果，本次實驗主要檢測從人原發(fā)性肝癌及癌旁組織中純化分離出CD8+T細胞中的自噬下游信號通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相關蛋白及ATG7 mRNA、LC3II mRNA的表達情況，探討人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4高表達對T細胞免疫抑制的影響。
　　方法：
　　本次實驗首

7、先采用免疫磁珠分選技術從同一來源的新鮮人原發(fā)性肝癌組織及癌旁組織中純化分離出CD8+T細胞，一方面利用Western Blot技術分別檢測兩組CD8+T細胞中自噬下游信號通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相關蛋白的表達情況；另一方面利用熒光定量PCR技術分別檢測兩組CD8+T細胞中ATG7及自噬標志性蛋白LC3II的mRNA表達情況。應用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用的統(tǒng)計方法為：兩樣本的t檢

8、驗，在 P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。從而探討人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4高表達對T細胞免疫抑制的影響。
　　結果：
　　（1）自噬相關蛋白 LC3I在原發(fā)性肝癌 CD8+T細胞中的表達明顯低于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計學意義（t=6.72，P=0.001）。
　　（2）自噬標志性蛋白LC3II在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計學意義（t=6.68，P=0.001）。
　?。?）自噬

9、相關蛋白ATG7在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計學意義（t=4.49，P=0.004）。
　?。?）自噬相關蛋白ATG5-ATG12在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計學意義（t=4.72，P=0.003）。
　　（5）ATG7 mRNA在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計學意義（t，=4.14，P=0.025）。
　?。?）LC3

10、II mRNA在原發(fā)性肝癌CD8+T細胞中的表達明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計學意義（t=4.29，P=0.005）。
　　結論：
　　自噬下游信號通路中 ATG7、ATG5-ATG12、LC3II相關蛋白的表達在原發(fā)性肝癌組織 CD8+T細胞中明顯高于癌旁組織，自噬相關蛋白 LC3I的表達在原發(fā)性肝癌組織CD8+T細胞中明顯低于癌旁組織；同時，ATG7及LC3II的mRNA的表達在原發(fā)性肝癌組織CD8+T細胞中明顯高于癌旁