血管緊張素Ⅱ在腫瘤乏氧微環(huán)境中生成的機(jī)制及介導(dǎo)腫瘤輻射抵抗的作用.pdf

1、目的:
　　研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ主要存在于腫瘤的乏氧區(qū)域，并且是由腫瘤細(xì)胞通過(guò)糜蛋白酶(chymase，CMA)依賴的途徑產(chǎn)生，而不是ACE依賴的經(jīng)典RAS途徑。并進(jìn)一步揭示了糜蛋白酶依賴途徑受到糖酵解代謝產(chǎn)物——乳酸水平調(diào)節(jié)，而且在乏氧腫瘤細(xì)胞中AngⅡ水平的增加對(duì)于HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)的累積起重要作用，并介導(dǎo)了乏氧腫瘤細(xì)胞的輻射抵抗。這不僅為深入理解頭頸部腫瘤乏氧介導(dǎo)的輻射抵抗機(jī)制提供新的理論依據(jù)，而且為克服頭頸部腫瘤放療抵抗從

2、而減少放療后殘留及復(fù)發(fā)提供了新的思路和手段。
　　方法:
　　1.檢測(cè)頭頸部腫瘤中血管緊張素Ⅱ在腫瘤乏氧區(qū)域的表達(dá)
　　運(yùn)用ELISA實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株和乳腺癌細(xì)胞株在體外不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）下的血管緊張素Ⅱ表達(dá)情況。構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，結(jié)合HIF-1α抗體，利用免疫熒光技術(shù)分析血管緊張素Ⅱ在腫瘤組織中的分布與HIF-1α表達(dá)區(qū)域的相關(guān)性，進(jìn)而分析AngⅡ與腫瘤乏氧區(qū)域的相關(guān)性。利用免疫熒光

3、技術(shù)分析血管緊張素Ⅱ在人鼻咽癌標(biāo)本中的分布與HIF-1α表達(dá)區(qū)的相關(guān)性，進(jìn)而分析AngⅡ與腫瘤乏氧區(qū)域的相關(guān)性。
　　2.檢測(cè)乏氧情況下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ的機(jī)制
　　利用AGT慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定抑制血管緊張素原表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和5-8F，并運(yùn)用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)基中AngⅡ的表達(dá)。通過(guò)皮下注射上述細(xì)胞株建立小鼠移植瘤模型，運(yùn)用免疫熒光技術(shù)分析移植瘤組織內(nèi)AngⅡ與哌莫硝唑標(biāo)記的腫瘤乏氧區(qū)域的相關(guān)

4、性。通過(guò)熒光定量PCR及Western B1ot技術(shù)檢測(cè)乏氧腫瘤細(xì)胞中血管緊張素原(AGT)、腎素(Renin)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的基因及蛋白的表達(dá)水平。針對(duì)RENIN和ACE各設(shè)計(jì)3條短干擾RNA片段(siRNA)，使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制細(xì)胞中RENIN和ACE的表達(dá)。然后利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）下鼻咽癌細(xì)胞株RENIN和ACE沉默后AngⅡ的表達(dá)情況。利用基因表達(dá)微陣列分析的方法找出顯著影響腫瘤細(xì)胞An

5、gⅡ形成的糜蛋白酶(chymase，CMA)，并使用Western Blot進(jìn)一步證實(shí)。然后通過(guò)構(gòu)建CMA的慢病毒載體抑制其表達(dá)，使用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）下鼻咽癌細(xì)胞株CMA沉默后的AngⅡ表達(dá)情況。
　　3.檢測(cè)改變培養(yǎng)基pH或加入乳酸是否影響腫瘤細(xì)胞血管緊張素Ⅱ的表達(dá)
　　通過(guò)使用1％鹽酸(HCl)和5％碳酸氫鈉(NaHCO3)將常氧條件下腫瘤細(xì)胞培基pH調(diào)整至乏氧條件培養(yǎng)的水平，或者將乏氧條件下腫

6、瘤細(xì)胞培基pH調(diào)整至常氧條件培養(yǎng)的水平，然后使用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pH調(diào)整后腫瘤細(xì)胞培基中AngⅡ表達(dá)情況。使用乳酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同氧環(huán)境下（常氧及乏氧）鼻咽癌細(xì)胞中乳酸的表達(dá)情況，并運(yùn)用ELISA的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）的培養(yǎng)基中加入乳酸鈉提高細(xì)胞內(nèi)乳酸水平或者加入草氨酸鈉抑制細(xì)胞內(nèi)乳酸生成后鼻咽癌細(xì)胞的AngⅡ表達(dá)情況。
　　4.檢測(cè)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸是否影響糜蛋白酶的表達(dá)
　　5.檢測(cè)乏氧腫瘤細(xì)胞中血管

7、緊張素Ⅱ與HIF-1α表達(dá)的關(guān)系
　　6.檢測(cè)血管緊張素Ⅱ與頭頸部腫瘤細(xì)胞輻射敏感性關(guān)系
　　7.統(tǒng)計(jì)分析
　　結(jié)果:
　　1.腫瘤乏氧區(qū)域存在局部血管緊張素Ⅱ
　　利用ELISA試劑盒檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、CNE2、5-8F及乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231不同氧濃度下的AngⅡ生成情況。結(jié)果顯示在體外普通培養(yǎng)條件(常氧)下，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中可檢測(cè)到少量AngⅡ生成，而在乏氧培養(yǎng)條件下，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基

8、中AngⅡ水平顯著升高。運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)常氧條件下培養(yǎng)的CNE2及MDA-MB-231僅有極少量的AngⅡ表達(dá)在胞漿中，而乏氧條件下培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞胞漿中AngⅡ表達(dá)明顯升高。在裸鼠的CNE2移植瘤模型中的熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AngⅡ主要集中在乏氧誘導(dǎo)因子HIF-1α高表達(dá)的乏氧區(qū)域。另外我們還收集了13例鼻咽癌腫瘤標(biāo)本，用激光共聚焦顯微鏡觀察到AngⅡ與HIF-1α表達(dá)于鼻咽癌腫瘤標(biāo)本的同一區(qū)域。在AGT穩(wěn)定敲除的鼻咽癌CNE2細(xì)胞

9、的動(dòng)物移植瘤模型中，我們通過(guò)組織免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在哌莫硝唑指示的腫瘤乏氧區(qū)域AngⅡ的表達(dá)明顯下降。這些結(jié)果均提示局部RAS存在于腫瘤的乏氧微環(huán)境中。
　　2.乏氧腫瘤細(xì)胞不是通過(guò)經(jīng)典的RAS途徑產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ
　　熒光定量PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌CNE2細(xì)胞株中只有腎素在乏氧條件下其基因及蛋白水平顯著升高，而AGT與ACE在乏氧條件下與常氧相比具有相似的表達(dá)水平。在特異性敲除腎素的CNE2和5

10、-8F鼻咽癌細(xì)胞株中，通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乏氧情況下兩細(xì)胞株培養(yǎng)基中的AngⅡ水平降低。而特異性敲除血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的CNE2和5-8F細(xì)胞株中則無(wú)此種改變。這些結(jié)果提示我們，在乏氧的腫瘤細(xì)胞中AngⅡ的產(chǎn)生可能并不依賴典型的RAS途徑。
　　3.乏氧腫瘤細(xì)胞通過(guò)糜蛋白酶依賴途徑產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ
　　基因表達(dá)微陣列分析結(jié)果顯示，在乏氧的CNE2細(xì)胞中糜蛋白酶轉(zhuǎn)錄顯著增加，并通過(guò)Western Blot進(jìn)一步得到了證實(shí)。我們

11、利用慢病毒載體，構(gòu)建了穩(wěn)定敲除CMA的CNE2和5-8F細(xì)胞株。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乏氧培養(yǎng)環(huán)境中的鼻咽癌細(xì)胞株在CMA沉默后其AngⅡ表達(dá)較常氧情況下顯著降低。以上研究結(jié)果表明，在腫瘤的乏氧微環(huán)境中，糜蛋白酶介導(dǎo)AngⅡ的生成途徑可能是ACE依賴AngⅡ生成途徑的替代通路。
　　4.腫瘤來(lái)源的乳酸介導(dǎo)了乏氧腫瘤細(xì)胞血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生
　　運(yùn)用ELISA檢測(cè)不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）中鼻咽癌細(xì)胞CNE2及5-8F的培養(yǎng)基中

12、加入乳酸鈉提高細(xì)胞內(nèi)乳酸水平或者加入草氨酸鈉抑制細(xì)胞內(nèi)乳酸生成后其AngⅡ的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，用HC1酸化培養(yǎng)基后并未顯著增加培養(yǎng)基中AngⅡ的含量，相反，利用5％碳酸氫鈉(NaHCO3)將乏氧條件下培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞培基pH調(diào)整至常氧條件培養(yǎng)的水平后AngⅡ的含量上升。以上研究結(jié)果表明酸性pH并不是影響乏氧腫瘤細(xì)胞CMA依賴途徑生成AngⅡ的主要因素。而乳酸測(cè)定的結(jié)果顯示，乏氧條件培養(yǎng)的CNE2及5-8F細(xì)胞中乳酸水平較常氧條件下顯著升

13、高。在CNE2及5-8F細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入乳酸鹽后，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)常氧及乏氧條件下的培養(yǎng)基中AngⅡ水平顯著增高，加入草氨酸鈉后抑制胞內(nèi)乳酸生成后AngⅡ水平則降低，而挽救實(shí)驗(yàn)可恢復(fù)兩種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中的AngⅡ水平。這就說(shuō)明是乳酸而不是pH的降低引起乏氧腫瘤細(xì)胞中AngⅡ水平的增加。
　　5.腫瘤產(chǎn)生的乳酸調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中糜蛋白酶的表達(dá)
　　Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，無(wú)論常氧還是乏氧培養(yǎng)條件，在CNE2細(xì)胞

14、培養(yǎng)基中加入乳酸鹽后其糜蛋白酶的表達(dá)增加，加入草氨酸鈉后則發(fā)生抑制。在CNE2細(xì)胞培養(yǎng)基中加入碳酸氫鈉堿化培養(yǎng)基后，兩種培養(yǎng)條件下的糜蛋白酶亦有所增加。此外，乳酸鹽及培養(yǎng)基的堿化也使腎素的表達(dá)一定程度上升高。這些研究結(jié)果表明，乏氧腫瘤細(xì)胞中乳酸水平的增加可能是造成糜蛋白酶表達(dá)升高的重要因素。
　　6.血管緊張素Ⅱ調(diào)節(jié)乏氧腫瘤細(xì)胞中HIF-1α蛋白的累積
　　Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示，AngⅡ處理及乏氧條件下的CNE2

15、細(xì)胞中HIF-1α蛋白顯著升高，而加入坎地沙坦后可抑制HIF-1α蛋白的升高。在AGT穩(wěn)定敲除的鼻咽癌CNE2細(xì)胞的動(dòng)物移植瘤模型中，我們通過(guò)組織免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AGT沉默后，大大減弱了HIF-1α蛋白在哌莫硝唑標(biāo)記的腫瘤乏氧區(qū)域中的積累。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在乏氧腫瘤微環(huán)境中AngⅡ參與調(diào)節(jié)HIF1-α蛋白的累積。
　　7.局部生成血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)了乏氧腫瘤細(xì)胞的輻射抵抗
　　克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，乏氧條件下鼻咽癌CNE2及5-8

16、F細(xì)胞的輻射抵抗能力較常氧條件下顯著增加，而AT1R特異性拮抗劑坎地沙坦能逆轉(zhuǎn)乏氧條件造成的腫瘤細(xì)胞輻射抵抗，顯著增加其輻射敏感性。裸鼠的CNE2細(xì)胞株皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AT1R拮抗劑坎地沙坦處理組較對(duì)照組顯著減小了10Gy輻射后的腫瘤體積。在AGT穩(wěn)定敲除的鼻咽癌CNE2及5-8F細(xì)胞的動(dòng)物移植瘤模型中，AGT沉默組小鼠的移植瘤體積在10Gy輻射后較陰性對(duì)照組顯著降低。這些結(jié)果均表明，腫瘤乏氧微環(huán)境中AngⅡ的增加介導(dǎo)了腫瘤的輻射抵抗，

17、使用AT1R拮抗劑坎地沙坦可以特異地在乏氧環(huán)境下增加腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性。
　　結(jié)論:
　　本研究揭示了局部RAS主要存在于腫瘤的乏氧區(qū)域，腫瘤細(xì)胞可能主要通過(guò)糜蛋白酶(chymase，CMA)依賴的途徑產(chǎn)生AngⅡ，而不是ACE依賴的途徑，并以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的乳酸，而非乏氧環(huán)境的pH降低，通過(guò)激活乏氧腫瘤細(xì)胞的腎素及糜蛋白酶的表達(dá)引起AngⅡ的生成增加。最后，我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ可使乏氧腫瘤細(xì)胞中H