長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠機(jī)體影響的組織表達(dá)譜研究.pdf

1、在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸機(jī)理、消除運(yùn)動(dòng)疲勞提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的新方法篩選、運(yùn)動(dòng)能力的遺傳學(xué)研究、人類是否存在運(yùn)動(dòng)疲勞相關(guān)基因群等問(wèn)題是目前國(guó)際上諸多專家、學(xué)者高度關(guān)注和最令人振奮的課題。目前，中醫(yī)藥消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究，多以中醫(yī)理論的整體觀念出發(fā)，以臟腑學(xué)說(shuō)為中心，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論，運(yùn)用較先進(jìn)的科研手段和方法，使中醫(yī)的辯證論從宏觀走向微觀，中藥的研究從主觀判定向客觀指標(biāo)發(fā)展。我們應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)

2、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠機(jī)體的影響，為探討運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生的規(guī)律和機(jī)制，選擇科學(xué)的中藥加速疲勞消除，提高運(yùn)動(dòng)能力提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 組織芯片具有體積小、信息含量高、并可根據(jù)不同的需要進(jìn)行組合和設(shè)計(jì)的特點(diǎn)。它適用于免疫組化操作、原位PCR、原位雜交，并能大大提高實(shí)驗(yàn)效率，而且可根據(jù)需要靈活設(shè)計(jì)，所得結(jié)果均一可靠、可比性強(qiáng)，具有高通量、并行性、多樣本、省時(shí)快速、簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)、用途廣泛、結(jié)果可靠、便于設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)照等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首次將組織芯片技術(shù)引入運(yùn)動(dòng)

3、人體科學(xué)研究領(lǐng)域，建立了運(yùn)動(dòng)大鼠組織芯片，為組織芯片技術(shù)在運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了探究性研究。 材料與方法：采用健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由西安中醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼料采用該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料。實(shí)驗(yàn)大鼠均為3月齡，其平均體重為255±20g，共48只。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，常規(guī)光照，，動(dòng)物室溫度為18℃～23℃，濕度40～60％。加藥組每日以長(zhǎng)苞凹舌

4、蘭提取物灌胃1ml，其余則灌胃安慰劑蒸餾水。按實(shí)驗(yàn)要求將大鼠分為安靜對(duì)照組，有氧訓(xùn)練組，大強(qiáng)度疲勞組，服藥對(duì)照組，服藥有氧組，服藥大強(qiáng)度組各8只。 長(zhǎng)苞凹舌蘭藥材購(gòu)自陜西中藥材市場(chǎng)，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)院植物教研室任毅教授鑒定為蘭科植物長(zhǎng)苞凹舌蘭的G.conopsedR.Br.的塊莖。長(zhǎng)苞凹舌蘭藥材300g加入95％乙醇放入超聲發(fā)生儀提取3次，過(guò)濾，合并濾液，回收乙醇，入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)呈糊狀，至不再有酒精蒸出，以蒸餾水溶出備用

5、，溶液濃度1％。 運(yùn)動(dòng)方案：(1)對(duì)照組及加藥對(duì)照組：正?；\內(nèi)生活狀態(tài)，自由飲食，不運(yùn)動(dòng)。(2)有氧訓(xùn)練組及加藥有氧組：每周5d，共8week。適應(yīng)性訓(xùn)練3d后開始增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)速度：第1d，訓(xùn)練10min，速度10m/min，第2d訓(xùn)練15min，速度10m/min，第3d訓(xùn)練時(shí)間為15min，速度13m/min，如此，運(yùn)動(dòng)時(shí)間、速度隔日交替增加：先增時(shí)間，遞增時(shí)間5min，遞增速度3m/min。運(yùn)動(dòng)速度增至20m/min

6、，運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間增至60min后持續(xù)該強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量。 (3)疲勞訓(xùn)練組及加藥疲勞組：每周6d，共8week。適應(yīng)性訓(xùn)練3d后開始增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)速度：第1d速度10m/min，時(shí)間10min第2d速度10m/min，時(shí)間15min，第3d速度13m/min，時(shí)間15min。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加同上，當(dāng)運(yùn)動(dòng)速度增至20m/min，增加跑臺(tái)坡度為5度，最終運(yùn)動(dòng)速度增至35m/min，運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間增至60min。 大鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練8wee

7、k于末次訓(xùn)練后次日上午摘取眼球取血。待檢血紅蛋白、血睪酮和皮質(zhì)醇的血樣加入0.1％肝素抗凝，待檢其他指標(biāo)者離心取血清。灌注固定取材，摘取各組織、固定，制作組織芯片。 采用免疫組織化學(xué)SABC法觀察各組織Bax、Bcl-2、Cx43、Cx45、Hsp-27、c-fos指標(biāo)積分光密度的變化。 結(jié)果：1.不同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練強(qiáng)度可抑制大鼠體重的增長(zhǎng)率，尤其疲勞訓(xùn)練表現(xiàn)明顯；中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)體重的增長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響；有氧和疲勞訓(xùn)練對(duì)

8、提高心臟重量、心系數(shù)有著明顯的意義，中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)心系數(shù)無(wú)顯著影響。 2.中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物在一定程度上可以降低Bun濃度、升高血紅蛋白、血糖和血睪酮濃度，延緩疲勞的發(fā)生；中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物可在一定程度上改善運(yùn)動(dòng)性低T癥，提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力；同時(shí)它升高LDH、降低CK在血液中的濃度。 3.成功制備組織芯片。得到包含144組織點(diǎn)6套組織蠟塊，蠟塊完整，肉眼可見組織點(diǎn)排列整齊，無(wú)缺損現(xiàn)象。組織點(diǎn)直徑1mm，相距1m

9、m，切片厚度3μm。芯片各點(diǎn)陣排列整齊，薄厚均勻，HE染色層次分明，對(duì)比明顯，缺片率在0～2％之間，組織折疊現(xiàn)象少見；經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察顯示與大組織切片在形態(tài)學(xué)上無(wú)差異；與預(yù)設(shè)計(jì)符合率達(dá)95～100％。 4.建立大鼠了長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠機(jī)體影響的組織表達(dá)譜。5.Bax蛋白在心肌、肝組織和骨骼肌中表達(dá)最多，胃腸和血管平滑肌中表達(dá)較少；Bax蛋白表達(dá)量在服藥大鼠組織中，與對(duì)照組比較，具有顯著差異。 6.Bcl-2蛋白在

10、肝組織、心肌表達(dá)較多，在胃腸平滑肌、血管平滑肌及骨骼肌中表達(dá)較少；在某些組織中服藥組表達(dá)顯著性減少，而在另外一些組織中則相反，提示藥物對(duì)蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響。 7.中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增高骨骼肌和肝組織中Bcl-2/Bax值，提示中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練比安靜狀態(tài)時(shí)大鼠骨骼肌和肝組織細(xì)胞更不易發(fā)生凋亡，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌和肝組織具有保護(hù)作用；大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，Bcl-2在骨骼肌中的表達(dá)顯著降低，Bcl-2/Bax值大強(qiáng)度組小于服藥大強(qiáng)度疲勞組

11、，提示中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中對(duì)骨骼肌有保護(hù)作用；中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大鼠的心肌Bcl-2/Bax比值無(wú)顯著性影響；中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)大鼠的心肌Bcl-2/Bax基本無(wú)影響；中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物可以有效地降低血管平滑肌Bcl-2/Bax比值，具有保護(hù)血管平滑肌作用。 8.c-fos蛋白在肝組織及心肌和骨骼肌中表達(dá)較多，在其他組織中表達(dá)較少；服藥組大鼠肝組織內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)量大幅度下降，提示中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物有保

12、護(hù)肝組織的作用；而在骨骼肌和血管平滑肌中服藥組較未服藥組表達(dá)上升；服藥組大鼠的心肌c-fos表達(dá)量與未服藥組沒(méi)有明顯區(qū)別，提示中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)大鼠心肌影響不大。 9.中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)Hsp-27蛋白在有氧訓(xùn)練組和大強(qiáng)度疲勞組表達(dá)的影響大于安靜對(duì)照組，服藥有氧組和有氧訓(xùn)練組相比，除了肝組織和血管平滑肌外，其他組織的Hsp27蛋白表達(dá)均較有氧訓(xùn)練組有較大幅度的下降，其中胃腸平滑肌、骨骼肌和心肌中Hsp27蛋白表達(dá)與有氧訓(xùn)

13、練組有顯著下降；在服藥大強(qiáng)度組也有類似表現(xiàn)。這說(shuō)明中藥長(zhǎng)苞凹舌蘭提取物對(duì)骨骼肌、心肌和肝組織有一定程度的保護(hù)作用。 10.Cx43在神經(jīng)系統(tǒng)中都有表達(dá)，其中在脊髓表達(dá)最為豐富，其次為海馬CAⅠ區(qū)、皮質(zhì)和小腦。隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，脊髓和皮質(zhì)中的Cx43表達(dá)兩變化不明顯，海馬CAⅠ區(qū)和CAⅢ區(qū)Cx43表達(dá)呈下降趨勢(shì)，而在小腦中Cx43的表達(dá)則表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)；隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加Cx43在心肌中的表達(dá)增加；而藥物干預(yù)對(duì)其亦有顯著的影響，