超低頻經(jīng)顱磁刺激對(duì)局部腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響.pdf

1、背景：
　　腦血管疾病由于其高患病率、高致死率和高致殘率，是威脅人類健康的一類重要疾病，給社會(huì)、家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central never system，CNS)損傷后，神經(jīng)功能的缺失是永久性的，不能恢復(fù)。但大量的研究表明，缺血缺氧損傷后相鄰及遠(yuǎn)隔區(qū)域會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞壞死和凋亡，并發(fā)廣泛遲發(fā)性腦缺血伴腦血流量下降;同時(shí)也可以激活少量的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)，使其

2、發(fā)生增殖、遷移、分化及整合，以修復(fù)受損的組織。越來(lái)越多的證據(jù)表明CNS具有潛在的自我修復(fù)能力，主要是因?yàn)樵趥?cè)腦室下區(qū)(SVZ)、海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)、大腦皮質(zhì)、第四腦室和脊髓中央管等部位存在可以向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的神經(jīng)干細(xì)胞。在多種病變或某些因素刺激下這些NSCs可被激活，增殖后，在某些趨化因子的引導(dǎo)下遷移向損傷部位，并發(fā)生分化與整合，但是新生干細(xì)胞的數(shù)量和存活時(shí)間有限，且主要形成膠質(zhì)瘢痕，不能良好的修復(fù)受

3、損神經(jīng)組織。不同部位的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)不同的病變或損傷，激活情況不同。海馬齒狀回是NSCs主要存在的區(qū)域之一，而且對(duì)腦卒中和神經(jīng)退行性變等神經(jīng)損傷反應(yīng)較為敏感，如缺血再灌注損傷未直接作用于海馬，但病理檢查發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)明顯的細(xì)胞改變，并有明顯的神經(jīng)再生。腦損傷后，存在較多影響NSCs激活、增殖的因素，如年齡、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)等。巢蛋白(nestin)是原始神經(jīng)組織表達(dá)的一種中間絲結(jié)構(gòu)蛋白，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。nestin主要在未分化、具有分裂能

4、力的細(xì)胞表達(dá)，其表達(dá)與干細(xì)胞成熟的終末分化過(guò)程相一致。因此，我們將nestin視為神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前提細(xì)胞的標(biāo)志之一，用于NSCs的鑒定。而5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)是一種胸腺嘧啶核苷酸類似物，在細(xì)胞增殖周期嵌入細(xì)胞核DNA中，從而標(biāo)記新生細(xì)胞，我們將Brdu陽(yáng)性細(xì)胞視為新增殖的細(xì)胞。
　　重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)技術(shù)是利用電磁感應(yīng)原

5、理，將脈沖磁場(chǎng)作用于腦部，通過(guò)改變刺激頻率使皮層神經(jīng)細(xì)胞的膜電位發(fā)生變化，使之產(chǎn)生感應(yīng)電流，影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動(dòng)，從而導(dǎo)致CNS變化的磁刺激技術(shù)。rTMS被廣泛應(yīng)用于人類腦生理功能如運(yùn)動(dòng)、視覺(jué)、語(yǔ)言等和疾病狀態(tài)下腦的病理生理改變等的研究。近年來(lái)rTMS在治療腦損傷疾病如帕金森病、抑郁、腦血管疾病等和精神類疾病如抑郁、焦慮、失眠等取得了良好的效果。有研究證實(shí)，采用rTMS治療缺血性腦卒中，可明顯改善病人包括精細(xì)動(dòng)作等的運(yùn)動(dòng)功能、看圖識(shí)

6、物能力、命名能力及語(yǔ)言表達(dá)能力。刺激頻率不同，rTMS對(duì)CNS的作用不同，高頻(＞1Hz)刺激可以增加局部皮質(zhì)的興奮性和血流量，相反，低頻(≤1Hz)刺激可以降低皮質(zhì)興奮性和血流量。rTMS為多脈沖磁場(chǎng)，而超低頻磁刺激(ultra-low-frequency transcranial magneticstimulation，ULF-TMS)刺激頻率＜0.2Hz，為連續(xù)磁場(chǎng)。ULF-TMS可通過(guò)干預(yù)神經(jīng)遞質(zhì)的活性影響腦的功能，具有特殊的生

7、物物理特性及臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著ULF-TMS應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬，其治療機(jī)制的問(wèn)題也日益受到人們的重視。目前的許多研究提示rTMS治療CNS疾病可能通過(guò)影響NSCs而發(fā)揮作用，如rTMS可促進(jìn)海馬齒狀回BDNF，5-HT的表達(dá)，而B(niǎo)DNF，5-HT則是NSCs的正性調(diào)節(jié)因子;rTMS可引起腦內(nèi)微環(huán)境的變化，而微環(huán)境則是影響NSCs的重要因素。ULF-TMS的連續(xù)磁場(chǎng)可在腦區(qū)產(chǎn)生超低頻電流，進(jìn)而模擬多種神經(jīng)遞質(zhì)的慢突觸后電位的作用。施加的U

8、LF-TMS頻率不同，可分別影響興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，1mHzULF-TMS與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-GABA的活動(dòng)有關(guān)，11 mHzULF-TMS則對(duì)應(yīng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)。本實(shí)驗(yàn)比較1mHz、11mHz頻率的ULF-TMS與10Hz的rTMS對(duì)NSCs的影響，研究不同頻率的ULF-TMS在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)局部腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用及對(duì)模型大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活、增殖的影響。
　　目的：

9、
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較2種ULF-TMS與10Hz的rTMS對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響，研究不同頻率的ULF-TMS在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)局部腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用以及對(duì)模型大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活、增殖的影響。
　　方法：
　　1、線栓法制備SD大鼠左側(cè)缺血再灌注損傷模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分配到1mHz7天組、1mHz14天組、1mHz21天組，11 mHz7天組、11mHz14天組、11mH

10、z21天組，10Hz7天組、10Hz14天組、10Hz21天組及假刺激7天組、假刺激14天組、假刺激21天組;另手術(shù)制備假手術(shù)組。2、1 mHz組、11mHz組分別給予頻率為1 mHz、11 mHz的ULF-TMS;10Hz組施加頻率為10Hz的rTMS;刺激強(qiáng)度均為500 Gs，每次15 min，1次/d;假刺激組同樣放置磁刺激儀，但不給予磁刺激，余處理同磁刺激組;假手術(shù)組自然飼養(yǎng)。3、各組大鼠在處死前24小時(shí)腹腔注射Brdu。4、分

11、別在第7天、第14天及第21天應(yīng)用18分制神經(jīng)功能障礙評(píng)分方法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定。5、將評(píng)分后的模型大鼠處死后取腦，置4％多聚甲醛中后固定過(guò)夜，之后石蠟包埋，行連續(xù)冠狀位切片，取切片分別行HE染色及免疫組化SABC法檢測(cè)nestin及Brdu的表達(dá)水平;Western Blot檢測(cè)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)nestin蛋白表達(dá)水平。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：
　　膠片用掃描儀將圖像輸入電腦，利用Image-Pro Plus軟件

12、測(cè)定免疫組化nestin陽(yáng)性及BrdU陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度;Image-Pro Plus圖像分析軟件測(cè)定nestin和內(nèi)參GAPDH條帶平均灰度值，nestin蛋白相對(duì)表達(dá)量用兩者的比值表示。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)結(jié)果均以（(X)±S）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步行兩兩比較（LSD法），以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1、假手術(shù)組在不同時(shí)間點(diǎn)，神經(jīng)行

13、為學(xué)評(píng)分未見(jiàn)明顯變化，且均高于假刺激組及磁刺激組;第7天，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分三組磁刺激組與假刺激組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在14天、21天，1 mHz ULF-TMS組、11mHz ULF-TMS組和10Hz rTMS組評(píng)分均高于假刺激組;但10Hz組評(píng)分較高，與1mHz、11 mHz評(píng)分有差異;1mHz與11 mHz相比則無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、磁刺激組及假刺激組大鼠海馬部位均可見(jiàn)到nestin陽(yáng)性的細(xì)胞，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色，主要沉積在

14、胞漿;在7天、14天、21天，假刺激組nestin平均光密度均高于假手術(shù)組;在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，3組磁刺激組nestin平均光密度較假刺激組明顯增高;但10Hz組與1mHz、11 mHz有差異，其值較高;1mHz與11 mHz相比則無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、Brdu陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，陽(yáng)性物質(zhì)主要沉積在胞核;不同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組Brdu陽(yáng)性平均光密度明顯低于磁刺激組及假刺激組;在第7天、14天、21天，10Hz組與1mHz組、11 mHz

15、組、假刺激組相比，Brdu陽(yáng)性平均光密度增多;1mHz組、11 mHz組和假刺激組之間3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異。
　　4、Western蛋白印跡顯示假手術(shù)組nestin蛋白幾乎無(wú)表達(dá);10Hz組與1mHz組、11 mHz組nestin蛋白表達(dá)均較假刺激組明顯增多;10Hz組表達(dá)的nestin蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)與1 mHz組、11mHz組相比有顯著性差異，10Hz組表達(dá)較多;1mHz與11 mHz之間表達(dá)差異不明顯。
　　結(jié)論：

16、
　　1、1 mHz ULF-TMS、11 mHz ULF-TMS和10Hz的rTMS均可促進(jìn)局部腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù);但在不同時(shí)間點(diǎn)，1mHz ULF-TMS、11 mHzULF-TMS與10Hz的rTMS對(duì)促進(jìn)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的程度不同。
　　2、局部腦缺血再灌注損傷可引起模型大鼠海馬區(qū)NSCs的激活和增殖。
　　3、1mHz ULF-TMS、11mHz ULF-TMS和10Hz的rTMS在7天、