浙江省成人肺炎支原體感染檢測方法建立及耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是引起社區(qū)獲得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）的常見病原體，肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)可占CAP的10％～40％。人類對MP普遍易感，既往研究以兒童為主，而根據(jù)我國最近的CAP致病原調(diào)查結(jié)果顯示，MP已成為成人CAP的首要致病原，故而對成人MPP的研究具有十分重要的意義。由

2、于MP感染的臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)均缺乏特異性，所以探討早期有效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法顯得十分重要。MPP的治療首選大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，然而隨著該類抗生素的廣泛應(yīng)用，MP對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥情況越來越嚴(yán)重，特別是在我國，諸多地區(qū)的耐藥率均已達(dá)90％以上。MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制主要是藥物作用靶位23SrRNA基因點(diǎn)突變，其中最為常見的是A2063G位點(diǎn)突變。本研究采用培養(yǎng)法、巢式PCR及血清學(xué)方法對成人MPP進(jìn)行檢測分析，建立成人MP早期感染

3、的快速診斷方法。同時(shí)了解浙江地區(qū)MP耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.通過對浙江地區(qū)成人CAP患者的咽拭子標(biāo)本及血清標(biāo)本進(jìn)行檢測分析，探討不同檢測方法對成人MPP診斷的臨床價(jià)值。
　　2.了解本地區(qū)成人MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥情況及主要的耐藥機(jī)制，并分析MP23S rRNA基因突變位點(diǎn)與耐藥表型之間的關(guān)系，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.標(biāo)本來源:收

4、集2012年1月～2014年8月于浙江省三所醫(yī)院就診的成人CAP患者的咽拭子及血清標(biāo)本，共650份。
　　2.成人MP感染檢測方法的研究:選取90例成人CAP患者的咽拭子及血清標(biāo)本，采用ELISA法、被動(dòng)凝集法檢測血清MP抗體;對臨床咽拭子標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行分離培養(yǎng);提取咽拭子標(biāo)本中的DNA，聯(lián)合正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)優(yōu)化巢式PCR條件，在優(yōu)化的基礎(chǔ)上用巢式PCR分別擴(kuò)增P1、16S rRNA基因，比較檢測結(jié)果。
　　3.MP

5、耐藥機(jī)制的研究:對650份成人咽拭子標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，應(yīng)用巢式PCR對臨床分離株進(jìn)行分子鑒定，采用體外藥物敏感性試驗(yàn)測定MP臨床分離株的最小抑菌濃度(MIC)，篩選耐藥菌株;應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增MP23S rRNAⅤ區(qū)基因，產(chǎn)物進(jìn)行測序，觀察其突變情況。
　　結(jié)果：
　　1.90份受檢患者的標(biāo)本中，PPA法檢測陽性65例(72.2％)，ELISA法檢測MP-IgA陽性24例(26.7％)，MP-IgM陽性20例(22.2％)，

6、MP-IgG陽性34例(37.8％)。PPA法的滴度越高，ELISA法檢測MP-IgA、MP-IgM陽性檢出率越高。以16SrRNA基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行巢式PCR可以檢出MP的最低DNA濃度為1×10-5ng/μl，以P1基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行巢式PCR可以檢出MP的最低DNA濃度為1×10-4ng/μl，故而巢式PCR擴(kuò)增16SrRNA基因的靈敏度要高于P1基因。另外，巢式PCR擴(kuò)增16 SrRNA基因檢測MP陽性39例(43.3％)，P1基因

7、陽性32例(35.5％)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MP臨床菌株分離培養(yǎng)陽性8例(8.9％)。
　　2.650份咽拭子標(biāo)本中MP分離培養(yǎng)陽性71例;根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，71株MP臨床分離株對紅霉素（MIC:128-＞256μg/ml）、克拉霉素(MIC:128-＞256μg/ml)、阿奇霉素(MIC:32-＞64μg/ml)均耐藥，未發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類、喹諾酮類耐藥株。所有的臨床耐藥MP株均存在A2063G點(diǎn)突變，并未發(fā)