洋蔥伯克氏菌WZ1對二氯喹啉酸脅迫的應(yīng)激反應(yīng)及其降解機(jī)制研究.pdf

1、浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文洋蔥伯克氏菌WZ1對二氯喹啉酸脅迫的應(yīng)激反應(yīng)及其降解機(jī)制研究姓名：李子木申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：閔航20080501摘要會對菌株WZl造成傷害。而菌株WZl則通過分泌熱激蛋白70、超氧化物岐化酶、CutAl二價離子耐受蛋白、DNA錯配修復(fù)蛋白MutS等具保護(hù)功能和解毒能力的蛋白質(zhì)來緩解二氯喹啉酸造成的損害。二氯喹啉酸脅迫下還有多種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，這可能與菌株WZl轉(zhuǎn)運(yùn)二氯喹啉酸

2、代謝產(chǎn)物或細(xì)胞內(nèi)其他毒害物質(zhì)的過程有關(guān)。4通過雙向電泳實(shí)驗，還鑒定到了可能參與二氯喹啉酸代謝過程的2個關(guān)鍵酶——鄰苯二甲酸雙加氧酶(PDR)和氯鄰苯二酚1，2雙加氧酶(12CCD)。用傳統(tǒng)酶活檢測方法測定了這2種酶在含二氯喹啉酸的培養(yǎng)液中菌株不同培養(yǎng)階段的酶活比，發(fā)現(xiàn)這2種酶的酶活變化與菌株WZl利用二氯喹啉酸的生長情況相符，證明菌株利用二氯喹啉酸的能力與這2種酶的酶活密切相關(guān)。通過GCMS檢測到3種可能的二氯喹啉酸中間代謝產(chǎn)物，結(jié)合降

3、解過程中的關(guān)鍵酶，初步推測二氯喹啉酸的降解途徑為：菌株WZl首先通過脫羧作用將3，7二氯喹啉酸轉(zhuǎn)化為3，7二氯喹啉，經(jīng)氧化裂解后打開含氮的環(huán)，再經(jīng)過基團(tuán)轉(zhuǎn)移等作用轉(zhuǎn)化為2甲酸5氯苯胺，轉(zhuǎn)氨作用后形成氯化鄰苯二甲酸，然后經(jīng)過上述測得的鄰苯二甲酸雙加氧酶和氯鄰苯二酚1，2雙加氧酶作用后最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)。5利用Northern雜交和RTPCR進(jìn)一步檢測二氯喹啉酸的降解關(guān)鍵酶——氯鄰苯二酚1，2雙加氧酶。通過設(shè)計該酶的引物從菌株WZl的基因組

4、中擴(kuò)增到了氯鄰苯二酚1，2雙加氧酶的部分基因片段。用該基因片段制備探針后進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果證明了該酶的確系由二氯喹啉酸誘導(dǎo)表達(dá)。此外，還將該菌株的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行了該酶的cDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果與在菌株WZl基因組上的擴(kuò)增結(jié)果一致。兩個實(shí)驗從不同的角度在RNA表達(dá)水平上證明了菌株WZl的氯鄰苯二酚1，2雙加氧酶由二氯喹啉酸誘導(dǎo)產(chǎn)生，并在二氯喹啉酸的降解過程中發(fā)揮著重要作用。關(guān)鍵詞：洋蔥伯克氏菌WZl；二氯喹啉酸；雙