國內(nèi)衣原體流行株的基因組分析與毒力基因克隆表達.pdf

1、衣原體（Chlamydia）是一類專性細胞內(nèi)寄生的細菌，二相發(fā)育周期使其感染機制獨特，引發(fā)的各類疾病難以控制。衣原體的發(fā)育周期為原體（elementary body，EB）首先吸附細胞并通過細胞吞飲作用進入細胞，宿主細胞包裹EB形成空泡后EB發(fā)育為網(wǎng)狀體（reticulate body，RB），后者無感染性但可通過二分裂形式進行繁殖，RB分化為EB后衣原體完成一輪生長發(fā)育。
　　鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci，

2、Cps）屬于衣原體屬，分布廣泛，尤其是家禽家畜自然感染普遍，多以潛伏性感染為主。人類可通過呼吸道-氣溶膠、皮膚、粘膜等途徑引起感染，輕癥類似感冒癥狀，而重癥可出現(xiàn)全身中毒癥狀，甚至死亡。由于缺乏典型癥狀和診斷措施，Cps感染在臨床上誤診漏診眾多。另外，由于其易傳播性以及高致病性，Cps已被列入國際《禁止生物武器公約》中的經(jīng)典生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。
　　沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）也屬于衣原體屬，人

3、是Ct的唯一宿主，Ct導致的疾病多為自限性疾病，反復感染或長期感染導致的炎癥反應可使宿主患不孕、異位妊娠、失明等嚴重疾病[1]。其中致盲性沙眼和泌尿生殖系統(tǒng)的感染分別是發(fā)展中國家和發(fā)達國家的一種社會問題。世界衛(wèi)生組織旨在2020年消滅致盲性沙眼[2]，許多國家為了消滅沙眼采取WHO的SAFE策略并取得了顯著進步[3]，然而十多年后是否完成可持續(xù)地消滅沙眼的目標仍是未知數(shù)。
　　Cps和Ct分別包含9種和15種ompA基因型，不同型

4、的不同衣原體種存在一定的宿主和組織感染嗜性。由于全基因組測序技術的快速發(fā)展，近年來國外報道了很多Cps和Ct基因組測序分析結果，加深了對這兩種病原體在不同地區(qū)與不同宿主共進化的認識。基因組的比較分析也為發(fā)現(xiàn)鑒定衣原體新型毒力基因提供了重要工具。作為一類缺乏研究的病原體，來自國內(nèi)的Cps或Ct基因組學報道及在此基礎上的毒力基因鑒定研究還很有限。
　　1.論文第一部分，首次分析了國內(nèi)Cps羊流產(chǎn)株CG1和眼型Ct分離株QH111L的全

5、基因組序列，這對加深理解Cps和Ct在我國的進化有重要意義。
　　1.1.Cps羊流產(chǎn)株CG1的全基因組序列測定與分析。前期研究發(fā)現(xiàn)，我國的Cps CG1流行株可以導致羊流產(chǎn)，Cps C型菌也在我國的牛、豬等哺乳動物和鴨等禽類中被分離到，這與國外Cps C型菌只在水禽類動物中被發(fā)現(xiàn)的報道不一致[4]。采用二代測序技術對CG1株進行基因組重測序，比對分析重測序序列結果和國外發(fā)表的C型菌GR9株的基因組序列。結果發(fā)現(xiàn)，與GR9株相比，

6、CG1的SNP變異位點多數(shù)集中于一段約23kb的固定區(qū)域（B598_0269-B598_0288）。將CG1的該區(qū)域進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)12個開放閱讀框均與流產(chǎn)衣原體高度同源，這或許可以用來解釋CG1可以感染哺乳動物（羊），并導致羊流產(chǎn)的原因。除了發(fā)現(xiàn)CG1中存在一段流產(chǎn)衣原體的基因序列，在基因組對比分析中我們還發(fā)現(xiàn)了CG1的B598_0681基因發(fā)生了無義突變，該基因編碼一個假定的包涵體膜蛋白。
　　1.2.眼型Ct分離株Q

7、H111L的全基因組測序與分析。QH111L為ompA基因B型，與B/Tunis-864株的ompA序列高度同源，只在LGV、F和G等UGT型菌株的ompA中被發(fā)現(xiàn)的密碼子改變出現(xiàn)在第91位氨基酸上，說明QH111L的ompA有UGT型特征。染色體全長序列的系統(tǒng)進化發(fā)育分析表明，QH111L屬于典型的眼型Ct分支，介于B和C型菌的分支之間，但與其它B或C型Ct的遺傳距離較遠。將QH111L與坦桑尼亞分離株B/TZ1A828的染色體序列進

8、行比對，發(fā)現(xiàn)22個ORF存在10個以上SNP差異，其中的9個ORF和12個ORF分別與C型菌和UGT型的同源性最高，說明QH111L的染色體序列具有C型和UGT型特征。Ct的質(zhì)粒序列高度保守，不同Ct分離株的質(zhì)粒間僅存在有限的SNP差異。QH111L質(zhì)粒屬于典型的眼型Ct分支，但其編碼的pgp2和pgp5基因分別含有一個UGT型SNP位點，這說明QH111L的質(zhì)粒與染色體存在共進化，與在ompA和染色體序列中發(fā)現(xiàn)UGT型特征相一致。

9、r>　　2.論文第二部分，對衣原體毒力基因（Ct和Cps的CT135同源基因、Cps的B598_0681基因等）進行克隆表達，為研究它們的致病機制奠定基礎。
　　2.1.Ct和Cps的CT135基因克隆表達。A-K型Ct在傳代培養(yǎng)時，CT135基因易發(fā)生無義突變，該基因可能與Ct的體外適應性生長有關。在雌鼠生殖道感染模型上，CT135變異與 Ct的感染持續(xù)時間、致病能力等顯著相關[5]，但該基因的表達、定位等仍沒有報道。一個主要原

10、因是A-K型衣原體在培養(yǎng)時CT135基因易發(fā)生無義突變，而在LGV型Ct中CT135基因雖保持完整但很可能無法正常表達。
　　CT135同源基因為衣原體科特異性，在Cps等其它衣原體中該基因不存在自發(fā)的無義突變現(xiàn)象。通過重構Cps CT135同源基因（B598_0590）的原核表達載體并誘導表達蛋白，切膠純化方式純化目的蛋白，免疫小鼠制備血清多抗。對感染CG1的HeLa229細胞進行甲醇固定，用抗血清作一抗，免疫熒光實驗觀察蛋白在

11、細胞中的定位。發(fā)現(xiàn)B598_0590基因編碼的蛋白在包涵體膜上濃染，這與已知的IncA蛋白類似，證實了B598_0590基因編碼包涵體膜蛋白，但其染色特征與IncA存在差異，在包涵體上呈現(xiàn)不均勻分布，這可能與其功能有關。
　　采用相同的方法克隆表達Ct CT135基因，多次嘗試后發(fā)現(xiàn)不能獲得重組蛋白，這與Cps CT135同源基因的表達結果不一致。用qPCR技術在E.coli中分析了蛋白未能表達的原因，發(fā)現(xiàn)誘導后CT135 mRN

12、A的量出現(xiàn)大幅下降，與mRNA量上調(diào)的預期不符。將原核表達載體中CT135基因的起始密碼子ATG中的A刪除，qPCR實驗發(fā)現(xiàn)誘導后CT135 mRNA的量大幅提高。這提示，低水平表達的CT135蛋白可能參與調(diào)節(jié)自身mRNA的穩(wěn)定性。最后我們發(fā)現(xiàn)，在表達載體中CT135的C端融合GST可獲得重組蛋白，為制備抗CT135抗體奠定了基礎。
　　2.2.Cps B598_0681基因的克隆表達。在體外傳代培養(yǎng)時，Ct的CT135基因易發(fā)生

13、變異。Cps的基因組穩(wěn)定性缺乏研究，我們上面通過對Cps CG1株的基因組測序分析發(fā)現(xiàn)B598_0681發(fā)生了無義突變，這可能與傳代培養(yǎng)相關，因為該基因只是在部分Cps分離株中發(fā)生了變異。B598_0681同樣編碼一個假定的科特異性包涵體膜蛋白，目前已完成了該蛋白的重組表達和純化。
　　總結：
　　對Cps CG1株和Ct QH111L株的基因組學研究對加深理解兩種衣原體在我國的適應性進化、對防控兩種衣原體病有重大意義，也為