鴨腎間充質(zhì)干細胞建系及普伐他汀對其增殖的影響.pdf

1、目的：建立北京鴨腎間充質(zhì)干細胞(Nephric Mesenchymal Stem Cells，NMSCs）的體外培養(yǎng)體系，研究其生物學特性，探究普伐他汀對鴨腎間充質(zhì)干細胞增殖作用的影響。
　　方法：⑴NMSCs的分離培養(yǎng)：以15日齡北京鴨胚胎腎為研究材料，采用混合酶消化法獲得NMSCs，并進行傳代、凍存和復蘇。⑵NMSCs生物學特性研究：形態(tài)學觀察；繪制細胞生長曲線，計算群體倍增時間；特異性表面標志物RT-PCR和免疫熒光檢測；多

2、向分化潛能鑒定：將NMSCs定向誘導成脂肪細胞、胰島細胞、肝樣細胞和上皮細胞，并對誘導后的細胞進行特異性染色、RT-PCR和免疫熒光鑒定。⑶普伐他汀對NMSCs增殖作用研究：將細胞隨機分為對照組和實驗組，實驗組向培養(yǎng)基中分別加入0.001、0.01、0.1、1、10μmol?L-1五種濃度的普伐他汀，觀察藥物作用后細胞的形態(tài)學變化；MTS比色法檢測細胞增殖情況；增殖基因熒光定量PCR檢測；流式細胞術(shù)檢測細胞特異性標記抗原和增殖核抗原的陽

3、性率。
　　結(jié)果：①北京鴨胚胎NMSCs傳至23代，呈長梭形，具有較強的增殖能力。②細胞生長曲線呈典型的“S”型，經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期，符合細胞體外生長的一般規(guī)律，細胞的群體倍增時間分別為31.85、35.07、40.98h。③RT-PCR檢測NMSCs陽性表達Vimentin、Fibronectin、CD29、CD71、CD44和CD73，陰性表達CD34和CD45，免疫熒光檢測NMSCs陽性表達Vimentin、

4、CD29、CD71和CD44。④成功地將NMSCs誘導為脂肪細胞、胰島細胞、肝樣細胞和上皮細胞。⑤普伐他汀作用76 h后細胞呈長梭形，形態(tài)無明顯變化。⑥經(jīng)MTS檢測，與對照組比較，普伐他汀組濃度為0.01、0.1、1μmol?L-1均可促進NMSCs增殖，濃度為0.001μmol?L-1對NMSCs增殖影響較小，10μmol?L-1對NMSCs無促增殖作用。⑦與對照組比較，普伐他汀組濃度為0.001、0.01、0.1μmol?L-1時增

5、殖基因Ki67的相對表達量升高，0.01、0.1、1μmol?L-1時增殖基因 PCNA的相對表達量升高，其他濃度組與對照組相比差異不顯著。⑧NMSCs經(jīng)0.1μmol?L-1普伐他汀作用1 w后，細胞表面標記抗原的表達量無明顯差異。Vimentin陽性率對照組為98.51％，實驗組為97.43%；CD44陽性率對照組為97.21%，實驗組為97.78%；細胞增殖核抗原的表達量增加，Ki67陽性率對照組為2.39%，實驗組為12.3%；

6、PCNA陽性率對照組為11.07%，實驗組為26.14%。
　　結(jié)論：成功建立了北京鴨胚胎腎間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)體系，并對NMSCs自我增殖和多向分化潛能進行鑒定，證實體外培養(yǎng)NMSCs為鴨胚胎腎來源的間充質(zhì)干細胞，與已知的間充質(zhì)干細胞具有相似的生物學特性。普伐他汀對NMSCs作用后不影響其細胞形態(tài)和生物學特性，普伐他汀濃度為0.001~1μmol?L-1時可促進NMSCs增殖，濃度為10μmol?L-1對NMSCs沒有促增殖作用