自噬對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠線粒體凋亡及炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、背景與目的：
　　多發(fā)性硬化（ multiple sclerosis, MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system)的自身免疫性疾病，其典型病理改變?yōu)榘踪|(zhì)脫髓鞘、炎癥細(xì)胞浸潤、軸突損傷及血腦屏障的破壞等，有新舊病灶共存的特點。多發(fā)性硬化的病理形成機制尚不完全明確，近年通過尸檢和一系列影像學(xué)等檢查發(fā)現(xiàn)廣泛的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡是最早出現(xiàn)的病理改變，并隨即出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活、聚集，而此時髓鞘形態(tài)完整，無明顯炎細(xì)

2、胞浸潤及軸突損傷等。之后數(shù)周甚至數(shù)月才出現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的浸潤、白質(zhì)脫髓鞘及軸突損傷等MS典型的病理改變，學(xué)者們用激活前損傷區(qū)（preactive lesion）的新概念來代表MS這種新發(fā)病灶出現(xiàn)時的早期病理改變，少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞激活聚集是激活前損傷區(qū)特征性的改變。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（ Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）C57BL/6小鼠模型是研究MS

3、的理想動物模型，病程中呈典型的緩解-復(fù)發(fā)過程。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，在EAE小鼠中，線粒體能量衰竭和損傷是引起少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的始動因素，可能是激活前損傷區(qū)形成的重要原因，從而導(dǎo)致MS典型病理改變的發(fā)生。并且我們發(fā)現(xiàn)線粒體損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡伴隨整個EAE病理過程，與疾病嚴(yán)重程度一致。但造成線粒體損傷的原因尚不清楚。自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的重要生物現(xiàn)象，當(dāng)線粒體受損時，細(xì)胞可啟動自噬來清除受損的線粒體及凋亡因子，從而保護細(xì)胞免于壞死、凋亡的危

4、險。此外，一系列研究證實自噬對T細(xì)胞具有前存活和前死亡的雙重作用，是自身免疫及炎癥反應(yīng)的重要介導(dǎo)者。在離體培養(yǎng)的單核細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)抑制自噬能促進(jìn)IL-1β的分泌。說明自噬對炎癥反應(yīng)的發(fā)生也起著至關(guān)重要的作用。本實驗探索自噬在 EAE病程中的時序變化，并探討自噬激活劑雷帕霉素（Rapamycin, RAP）對EAE線粒體凋亡的影響，以及予以自噬抑制劑3甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）后EAE小鼠炎癥反應(yīng)程度的變化，初

5、步闡明自噬對EAE小鼠線粒體凋亡及炎癥反應(yīng)的作用，旨在為多發(fā)性硬化的治療提供新的思路。
　　方法：
　　第一部分：將96只C57BL/6雌性小鼠分為正常組、EAE模型組、EAE+雷帕霉素組、EAE+PBS組，EAE+雷帕霉素組自免疫日起每日腹腔注射雷帕霉素（1mg/kg/d）。神經(jīng)功能評分觀察各組小鼠神經(jīng)功能變化。于免疫后3d、7d、16d、30d通過Western Blot檢測各組小鼠腦白質(zhì)Beclin-1及Cytochr

6、ome(cyt-c)表達(dá)水平，免疫熒光雙標(biāo)檢測免疫后7天caspase-3在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)水平。
　　第二部分：20只C57BL/6雌性小鼠建模后分別于3、7、16、30 d用Western blot檢測CNS中LC3B的變化。另將60只小鼠分為正常對照組、EAE模型組、EAE+3-MA組，EAE+3-MA組自免疫日起每日腹腔注射3-MA（100 nmol/μL，2μL/d）。神經(jīng)功能評分觀察各組小鼠神經(jīng)功能變化。免疫組化檢測

7、各組小鼠免疫后7 d小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況， Western blot檢測免疫后急性期（16d）、慢性期（30 d）白介素-1β（IL-1β）的表達(dá)，HE染色觀察CNS炎性細(xì)胞浸潤情況。
　　結(jié)果：
　　1.Western bolt示與正常組相比，EAE組LC3-II/LC3-I自免疫后7d開始降低（P<0.05），此后一直呈低表達(dá)水平（P<0.01）； beclin1表達(dá)水平與LC3B一致；cyt-c的表達(dá)自7d時顯著升高（P

8、<0.01）,于16d時達(dá)高峰（P<0.01）；自噬激活劑RAP能升高自噬相關(guān)蛋白beclin1的水平，抑制cyt-c表達(dá)水平（P<0.05）；免疫熒光雙標(biāo)示EAE免疫后7d少突膠質(zhì)細(xì)胞即高表達(dá) caspase-3， EAE+RAP組少突膠質(zhì)細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平低于模型組（P<0.05）；
　　2.免疫組織化學(xué)示EAE免疫后7 d即有小膠質(zhì)細(xì)胞激活，EAE+3-MA組EAE小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度較EAE模型組嚴(yán)重（P<0

9、.05）；Western bolt示免疫后16、30 d，EAE模型組高表達(dá)IL-1β，EAE+3-MA組小鼠IL-1β表達(dá)水平較同時間點EAE模型組高（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示， EAE+3-MA組炎細(xì)胞浸潤比同時間點EAE模型組加重（P<0.05），呈典型“血管袖套樣”改變；
　　3．EAE小鼠在最早免疫后9 d開始發(fā)病，大多數(shù)集中在12~16 d發(fā)病，并于16~20 d達(dá)到疾病高峰；EAE+RAP組EAE小鼠較模型組

10、神經(jīng)功能評分顯著降低，疾病嚴(yán)重程度減輕（P<0.01）；EAE+3-MA組小鼠發(fā)病時間提前，神經(jīng)功能評分增高，疾病嚴(yán)重程度加重（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在EAE免疫后7天就出現(xiàn)了自噬水平的降低，提示自噬水平的降低可能是EAE病理改變發(fā)生、發(fā)展的重要原因。
　　2.自噬激活劑雷帕霉素能增加EAE自噬水平，降低免疫后早期少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，減少病程中線粒體凋亡關(guān)鍵蛋白cyt-c釋放，可能是雷帕霉素通過增強自噬水