煙草中焦油與尼古丁對血栓調節(jié)蛋白表達和血栓調節(jié)蛋白與凝血酶相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預.pdf

1、吸煙是心血管疾病的獨立危險因素。在臨床實踐及以往文獻報道發(fā)現(xiàn)吸煙可以導致血管內血栓形成，引起急性心肌梗死的發(fā)生。但其機制目前并不清楚。內皮細胞在維持血流通暢、抵抗血栓形成等方面發(fā)揮著關鍵作用。血栓調節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）是內皮細胞表面具有很強抗凝活性的蛋白，它主要通過與凝血酶1∶1的高親和力結合，激活蛋白C發(fā)揮抗凝作用。這一抗凝過程不但受TM表達量的影響，同時也受其與凝血酶相互作用的影響。目前體外觀察吸煙對內皮細胞

2、TM表達的研究較少，焦油、尼古丁作為煙草中兩種重要的有害物質，被人們廣泛研究，但罕見報道其對內皮細胞TM表達的影響。瑞舒伐他汀作為新一代的降脂藥，不僅具有調節(jié)血脂的功能，還具有抗炎，抗血栓，改善血管內皮功能，穩(wěn)定斑塊等作用。但瑞舒伐他汀是否改善焦油與尼古丁對TM的表達并不清楚。另外，關于TM與凝血酶相互作用的研究，原子力顯微鏡(atomic forcemicroscopy，AFM)單分子力譜(single-molecule force

3、spectroscopy，SMFS)以其pN級的高分辨率實現(xiàn)了在活細胞表面單分子水平作用力的測定而具有獨特的優(yōu)越性。雖然近年來采用原子力顯微鏡對于生物分子間相互作用的研究越來越多，并不斷獲得新的進展，但是關于焦油與尼古丁對TM/凝血酶單分子間的相互作用及瑞舒伐他汀的干預的研究未見報道。
　　第一部分焦油與尼古丁對血栓調節(jié)蛋白表達的影響
　　目的:研究不同條件下焦油與尼古丁對人臍靜脈內皮細胞(humanumbilical ve

4、in endothelial cells，HUVECs)的增殖影響及表面TM表達的影響，從而探討吸煙導致血管內血栓形成的可能機制。
　　方法:以0.1％Ⅰ型膠原酶消化人臍靜脈內皮37℃15-20min，分離獲得原代HUVECs，在37℃、5％CO2孵箱內培養(yǎng)至融合后傳代，用Ⅷ因子相關抗原鑒定HUVECs，2-3代細胞用于實驗。
　　1、CCK-8法檢測焦油與尼古丁對HUVECs增殖的影響
　　將HUVECs接種于96孔

5、板，用不同濃度焦油（50mg/L，20 mg/L，10 mg/L,1 mg/L)、尼古?。?0-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)不同時間(6h、24h)孵育細胞。培養(yǎng)結束后，每孔加入10ul CCK-8溶液37℃，5％CO2孵箱內培養(yǎng)1-4h，酶標儀450nm波長測定吸光度A值。
　　2、流式細胞儀檢測焦油與尼古丁對HUVECs表面TM蛋白表達的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，

6、用不同濃度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一時間(6h)及同一濃度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同時間(0h、1h、6h、12h、24h)孵育細胞。流式細胞計數(shù)每組細胞平均熒光強度，檢測TM蛋白表達，每次計數(shù)30000個細胞。
　　3、熒光定量PCR檢測焦油與尼古丁對HUVECs表面TM mRNA表

7、達的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，用不同濃度焦油(50mg/L、20mg/L、10mg/L、1mg/L)、尼古丁(10-3mol/L,10-5mol/L,10-7mol/L,10-9mol/L)同一時間(6h)及同一濃度20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁不同時間(0h、1h、6h、12h、24h)孵育細胞。熒光定量PCR檢測TM mRNA表達。
　　結果:
　　1、CCK-8法檢測焦油與尼古丁對HUVE

8、Cs增殖的影響
　　與對照組相比，不同濃度焦油6h、24h組均可觀察到隨濃度的升高，A值逐漸降低的趨勢，但只有50mg/L焦油6h、24h組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。而不同濃度尼古丁6h、24h組與對照組相比可觀察到隨濃度的升高，A值逐漸升高的趨勢，但均無統(tǒng)計學差異。
　　2、流式細胞儀檢測焦油與尼古丁對HUVECs表面TM蛋白表達的影響
　　與對照組相比，不同濃度焦油組可以觀察到隨著焦油濃度的升高TM蛋白表達逐漸

9、增加，呈濃度依賴性，而且10mg/L焦油組即可達統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。與0h相比，不同時間焦油組也可觀察到隨著時間的延長TM蛋白表達逐漸增加，呈時間依賴性，而且6h即可達統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。并且觀察到6h內焦油組TM蛋白表達量增加最快，而隨時間延長，TM蛋白表達量增加速率則逐漸減慢。尼古丁組隨濃度、時間變化均對HUVECs表面TM蛋白表達無影響。
　　3、熒光定量PCR檢測焦油與尼古丁對HUVECs表面TM mRNA

10、表達的影響
　　與對照組相比，不同濃度焦油組可以觀察到隨著焦油濃度的升高TMmRNA表達逐漸增加，呈濃度依賴性，而且1mg/L焦油組即可達統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。與0h相比，不同時間焦油組也可觀察到隨著時間的延長TM mRNA表達逐漸增加，呈時間依賴性，而且1h即可達統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。并且觀察到6h內焦油組TM mRNA表達量增加最快，而隨時間延長，TM mRNA表達量增加速率則逐漸減慢。尼古丁組隨濃度、時間變化均對

11、HUVECs表面TM mRNA表達無影響。
　　結論:
　　1、焦油抑制HUVECs的增殖。尼古丁具有增強HUVECs增殖的趨勢。
　　2、焦油增加HUVECs表面TM的表達，呈濃度、時間依賴性。尼古丁對HUVECs表面TM的表達無影響。
　　第二部分瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對血栓調節(jié)蛋白表達及活性的影響
　　目的:研究瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對HUVECs的增殖影響及表面TM表達及活性的影響，從而探討

12、他汀類藥物改善吸煙致血管內血栓形成的可能機制。
　　方法:以0.1％Ⅰ型膠原酶消化人臍靜脈內皮37℃15-20min，分離獲得原代HUVECs，在37℃、5％CO2孵箱內培養(yǎng)至融合后傳代，第2-3代細胞用于實驗。
　　1、CCK-8法檢測瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對HUVECs增殖的影響
　　將HUVECs接種于96孔板，用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50mg/L焦油+50umol/L他汀，10-3mo

13、l/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀不同時間(6h、24h)孵育細胞。培養(yǎng)結束后，每孔加入10ul CCK-8溶液37。C，5％CO2孵箱內培養(yǎng)1-4h，酶標儀450nm波長測定吸光度A值。
　　2、流式細胞儀檢測瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對HUVECs表面TM蛋白表達的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mo

14、l/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀孵育細胞。流式細胞計數(shù)每組細胞平均熒光強度，檢測TM蛋白表達，每次計數(shù)30000個細胞。
　　3、熒光定量PCR檢測瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對HUVECs表面TM mRNA表達的影響
　　將HUVECs接種于6孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20 mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他

15、汀孵育細胞。熒光定量PCR檢測TM mRNA表達。
　　4 TM活性實驗檢測焦油與尼古丁對HUVECs表面TM活性的影響及瑞舒伐他汀的干預
　　將HUVECs接種于96孔板，用20mg/L焦油、10-5mol/L尼古丁、20mg/L焦油+50umol/L他汀，10-5mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀不同時間(6h、24h)孵育細胞。酶標儀405nm波長測定吸光度A值。
　　結果:
　　

16、1、CCK-8法檢測瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對HUVECs增殖的影響
　　與50mg/L焦油組相比，他汀+焦油組可增加吸光度A值(P＜0.05);但與對照組相比，他汀組無明顯統(tǒng)計學差異。他汀+尼古丁組與尼古丁組也無明顯統(tǒng)計學差異。
　　2、流式細胞儀檢測瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對HUVECs表面TM蛋白表達的影響
　　與對照組相比，他汀組可增加HUVECs表面TM蛋白表達(P＜0.05);與焦油組相比，他汀+焦油組

17、可增加HUVECs表面TM蛋白表達(P＜0.05);與尼古丁組相比，他汀+尼古丁組可增加HUVECs表面TM蛋白表達（P＜0.05）。
　　3、熒光定量PCR檢測瑞舒伐他汀干預焦油與尼古丁對HUVECs表面TM mRNA表達的影響
　　與對照組相比，他汀組可增加HUVECs表面TM mRNA表達(P＜0.05);與焦油組相比，他汀+焦油組可增加HUVECs表面TM mRNA表達(P＜0.05);與尼古丁組相比，他汀+尼古丁組

18、可增加HUVECs表面TM mRNA表達(P＜0.05)。
　　4、TM活性實驗檢測焦油與尼古丁對HUVECs表面TM活性的影響及瑞舒伐他汀的干預
　　與對照組相比，焦油組降低吸光度A值，降低TM的活性(P＜0.05);與焦油組相比，他汀+焦油組可增加吸光度A值（P＜0.05）;而尼古丁組與對照組相比吸光度A值無統(tǒng)計學差異，他汀+尼古丁組及他汀組與對照組相比可增加吸光度A值(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、

19、瑞舒伐他汀能改善焦油抑制的HUVECs增殖，但本身對HUVECs的增殖無影響。
　　2、瑞舒伐他汀可增加HUVECs表面TM的表達，并在焦油增加TM表達的基礎上，仍能再次上調TM的表達。
　　3、焦油降低TM活性，瑞舒伐他汀可改善這一效應，并且瑞舒伐他汀本身也可增加TM的活性。尼古丁對TM活性無影響。
　　第三部分單分子力譜檢測焦油與尼古丁對血栓調節(jié)蛋白與凝血酶相互作用的影響及瑞舒伐他汀的干預
　　目的:利用單分

20、子力譜法檢測焦油與尼古丁對TM與凝血酶單分子水平相互作用及瑞舒伐他汀的干預，從而探討吸煙導致血管內血栓形成及他汀類藥物抗血栓作用的可能機制。
　　方法:
　　1、pTM-GFP重組質粒轉染COS-7細胞及AFM分組測力
　　實驗分組:1）空白對照組（無質粒轉染）;2）對照組（質粒轉染）;3)50mg/L焦油孵育轉染細胞1h組（焦油組）;4）10-3mol/L尼古丁孵育轉染細胞1h組（尼古丁組）;5）50umol/L瑞舒

21、伐他汀+50mg/L焦油孵育轉染細胞1h組（他汀+焦油組）;6）50umol/L瑞舒伐他汀+10-3mol/L尼古丁孵育轉染細胞1h組（他汀+尼古丁組）;7）50umol/L瑞舒伐他汀孵育轉染細胞1h組（他汀組）。采用AFM及熒光倒置顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，在熒光倒置顯微鏡下觀察各組細胞表達的TM熒光融合蛋白聚集區(qū)，用凝血酶修飾的AFM探針反復隨機的在細胞表面蛋白聚集區(qū)下壓-回拉，獲得力-距離曲線，統(tǒng)計得出TM與凝血酶間結合力的高斯分布及成鍵幾

22、率。
　　2、流式細胞儀檢測焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對COS-7細胞表面TM熒光蛋白表達的影響
　　將轉染后的COS-7細胞接種于6孔板，用50mg/L焦油、10-3mol/L尼古丁、50mg/L焦油+50umol/L他汀，10-3mol/L尼古丁+50umol/L他汀，50umol/L他汀孵育細胞1h。流式細胞計數(shù)每組細胞平均熒光強度，檢測TM蛋白表達，每次計數(shù)30000個細胞。
　　結果:
　　1、AFM檢測

23、焦油與尼古丁對TM與凝血酶之間的相互作用及瑞舒伐他汀的干預
　　與對照組相比，焦油組可明顯降低TM與凝血酶間結合幾率(P＜0.05)，所得結合幾率低至＜5％，可視為分子間結合極低或無結合，無法計算TM與凝血酶間的分子結合力;與焦油組相比，他汀+焦油組可明顯增加TM與凝血酶間結合幾率(P＜0.05)，達到與對照組相當?shù)乃?，并且計算得出的他?焦油組的分子結合力明顯高于對照組（P＜0.05）。而尼古丁組與對照組相比在結合幾率和結合力

24、上均無統(tǒng)計學差異;他汀+尼古丁組與尼古丁組相比結合幾率雖無統(tǒng)計學差異，但是結合力卻明顯增加（P＜0.05）;他汀組與對照組相比結合幾率也無統(tǒng)計學差異，但結合力明顯增加（P＜0.05）。
　　2、流式細胞儀檢測焦油與尼古丁對COS-7細胞表面TM熒光蛋白表達的影響及瑞舒伐他汀的干預
　　與對照組相比，焦油組與他汀+焦油組可明顯增加COS-7細胞表面TM表達（P＜0.05）;尼古丁組、他汀組及尼古丁+他汀組與對照組相比均無統(tǒng)計學