腦出血后TLR4-NMDAR在NLRP3炎性體介導(dǎo)的炎癥性損害中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）是一種由腦組織自身出血引起的腦中風(fēng)，其致死率與致殘率顯著高于缺血性腦中風(fēng)和蛛網(wǎng)膜下腔出血。盡管如今醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)突飛猛進(jìn)，但對(duì)于腦出血仍無十分有效的治療措施。近年來研究發(fā)現(xiàn)，最初的出血以及血腫的占位效應(yīng)引起原發(fā)性腦損傷，而炎癥反應(yīng)則是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的重要原因。雖然近些年人們開始重視對(duì)腦出血的研究，但腦出血引起繼發(fā)性炎癥損傷的具體機(jī)制尚不是很明確。
　　腦出血后的炎癥

2、反應(yīng)主要是由于活化的炎癥細(xì)胞的積聚，例如血液細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞）和腦內(nèi)固有細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和肥大細(xì)胞）。這些活性細(xì)胞能釋放一些炎癥介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子、前列腺素和其他免疫活性分子。在所有炎癥細(xì)胞中第一個(gè)對(duì)腦損傷做出反應(yīng)的便是小膠質(zhì)細(xì)胞?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞形狀類似于血液巨噬細(xì)胞，因此它也被稱作腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞。大量研究結(jié)果證明，腦出血早期小膠質(zhì)細(xì)胞便被激活并釋放一系列有毒成分，包括細(xì)胞因子、趨化因子、環(huán)氧合酶2(CO

3、X-2)和活性氧(ROS)等。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞在腦出血后繼發(fā)性損傷中起到關(guān)鍵性作用。
　　在過去幾十年，先天免疫系統(tǒng)啟動(dòng)的機(jī)制被廣泛研究。病原相關(guān)分子模式(PAMP)和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMP)被認(rèn)為是主要引起先天免疫和炎癥反應(yīng)的兩種刺激方式。PAMP主要與外源性病原微生物感染有關(guān)，其中胞膜上的TLRs和胞漿內(nèi)的NLR這兩種模式受體家族，為典型的PAMP-PRR炎癥信號(hào)啟動(dòng)經(jīng)典通路。而DAMP則主要感受內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，包括破碎組

4、織細(xì)胞，及其相關(guān)代謝產(chǎn)物等，并由此誘發(fā)相關(guān)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)的炎癥性損害。近來研究發(fā)現(xiàn)NLRP3作為最具代表性的NLRs，它在識(shí)別損傷細(xì)胞或破碎組織等釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)分子過程中發(fā)揮不可或缺的作用。
　　腦出血繼發(fā)性損傷主要原因是腦組織炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞死亡，可導(dǎo)致腦水腫、鄰近血管收縮、細(xì)胞毒性和酸中毒等。然而，缺血性腦中風(fēng)也會(huì)產(chǎn)生以上情形，不過沒有腦出血如此嚴(yán)重。兩者嚴(yán)重程度的差異是由于神經(jīng)纖維網(wǎng)中血液的出現(xiàn)，其中游離血紅素(h

5、emin)可能為其主要原因。Hemin是血紅蛋白的分解產(chǎn)物，它是引起腦出血后繼發(fā)性腦損傷的主要因素之一。因其具有強(qiáng)氧化性，hemin成為機(jī)體危險(xiǎn)刺激信號(hào)，從而可激活天然免疫系統(tǒng)。
　　自1975年發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以直接作用于免疫，使動(dòng)物的免疫反應(yīng)形成條件反射，人們逐漸開始關(guān)注神經(jīng)與免疫的關(guān)系。長(zhǎng)期以來，人們一直認(rèn)為，免疫系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是通過免疫因子作用于神經(jīng)系統(tǒng)上的免疫受體發(fā)揮影響;反之，神經(jīng)系統(tǒng)可通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)或激素

6、，作用于免疫細(xì)胞上的神經(jīng)受體發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。在天然免疫系統(tǒng)中，NLRP3是最具代表性的免疫受體，也是誘導(dǎo)無菌性炎癥反應(yīng)至關(guān)重要的受體;在神經(jīng)系統(tǒng)中，N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)是一種門控離子通道型神經(jīng)受體，NMDA自主神經(jīng)可以支配各個(gè)免疫器官，有研究表明，NMDAR在小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中同樣發(fā)揮著重要作用，那么小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細(xì)胞，其同時(shí)還分別表達(dá)著典型的神經(jīng)受體NMDAR，以及典型的天

7、然免疫受體NLRP3，這兩種受體之間在啟動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的繼發(fā)性炎癥損害中存在怎樣的聯(lián)系，非常值得進(jìn)行深入細(xì)致的研究，遺憾的是至今尚未見任何相關(guān)研究報(bào)道。
　　目的:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)共同研究hemin對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞上TLR4和NLRP3炎性體成分表達(dá)的影響;進(jìn)一步研究TLR4和NLRP3這兩個(gè)炎癥受體之間的關(guān)系;探討神經(jīng)受體NMDAR1在免疫受體NLRP3活化中的作用。
　　方法:
　　1.建立hemin注入紋狀體模擬腦出血模型，蛋

8、白印跡技術(shù)(WB)檢測(cè)TLR4、NLRP3、ASC和IL-1β的表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)ASC和IL-1β在小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)情況。
　　2.Hemin刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，WB檢測(cè)TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的表達(dá)，ELISA檢測(cè)TNF-α和caspase-1的分泌情況。
　　3.通過動(dòng)物模型及體外細(xì)胞培養(yǎng)，明確TLR4在hemin誘導(dǎo)NLRP3活化中的作用，WB檢測(cè)TLR4缺失對(duì)NLRP3及IL-

9、1β表達(dá)的影響，免疫共沉淀(IP)檢測(cè)TLR4與NLRP3的相互作用。
　　4.觀察應(yīng)用NMDAR1抑制劑后，WB檢測(cè)NLRP3和IL-1β表達(dá)的變化，IP檢測(cè)NMDAR1與NLRP3的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.Hemin注入紋狀體可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，增加TLR4、NLRP3、ASC和IL-1β的表達(dá)。
　　2.Hemin刺激小膠質(zhì)細(xì)胞可上調(diào)TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的表

10、達(dá)及增加TNF-α和caspase-1的分泌，且具有一定的時(shí)間和濃度依賴性。
　　3.TLR4的缺失可減弱NLRP3炎性體的活化，且兩者可以產(chǎn)生直接相互作用。
　　4.抑制NMDAR1可降低NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)hemin刺激能增強(qiáng)NMDAR1與NLRP3的結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　腦出血后，hemin激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)NLRP3信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥性損害;同時(shí)，TLR4和NMDAR1通過與NLRP3產(chǎn)