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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
本課題探討了人參皂苷組合轉(zhuǎn)化組分(樣品A)對(duì)五種腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用;在此研究的基礎(chǔ)上,探討樣品A對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株的增殖抑制作用、促進(jìn)凋亡作用以及其對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響,并初步探討了其作用機(jī)制,為研究樣品A的抗腫瘤作用靶點(diǎn)和臨床前研究提供理論依據(jù)。
方法:
按常規(guī)方法培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
?、儆?0μg/ml、20μg/ml、40μg/m
2、l、80μg/ml和160μg/ml濃度梯度的樣品A,分別作用于人肝癌HepG2細(xì)胞株、人胃癌MGC-803細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株以及人宮頸癌Caski細(xì)胞株,分別培養(yǎng)作用24h、48h、72h后采用MTT法檢測(cè)5種腫瘤細(xì)胞的增殖情況,根據(jù)增殖抑制情況和IC50值,選擇抑制作用較好的細(xì)胞株,進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn);
?、谠趯?shí)驗(yàn)①的基礎(chǔ)上選擇人肝癌HepG2細(xì)胞株作為后期研究對(duì)象。選取20μg/ml、4
3、0μg/ml、80μg/ml濃度梯度的樣品A,以48h為作用時(shí)間,進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察(通過倒置顯微鏡和Hoechst33258熒光染色法);采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染技術(shù),在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)經(jīng)3種不同濃度樣品A作用48h后,人肝癌HepG2細(xì)胞株的凋亡情況;采用PI單染技術(shù),在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)藥物處理后人肝癌HepG2細(xì)胞株周期變化情況;
?、鄄捎肳estern blot免疫印跡技術(shù),檢測(cè)經(jīng)3種不同濃度樣品A作用48
4、h后,人肝癌HepG2細(xì)胞株中Bcl-2和Bax這兩種凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
結(jié)果:
?、贅悠稟作用于人肝癌HepG2細(xì)胞株、人胃癌MGC-803細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株、人宮頸癌Hela細(xì)胞株以及人宮頸癌Caski細(xì)胞株5種腫瘤細(xì)胞,均能產(chǎn)生一定程度的增殖抑制作用;其中,藥物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株的增殖抑制率可達(dá)到67.29%,作用最強(qiáng)。故而后期實(shí)驗(yàn)選用人肝癌HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,20μg/ml
5、、40μg/ml、80μg/ml濃度梯度的樣品A作用48h進(jìn)行實(shí)驗(yàn);
?、?0μg/ml、40μg/ml、80μg/ml濃度梯度的樣品A作用人肝癌HepG2細(xì)胞48h后,細(xì)胞較正常形態(tài)相比發(fā)生了變化:細(xì)胞膜皺縮,細(xì)胞開始邊緣模糊、變圓發(fā)亮進(jìn)而漂浮,染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核縮小斷裂顯點(diǎn)狀藍(lán)色熒光等凋亡特征,并呈一定的濃度依賴性;
?、劢?jīng)流式AnnexinⅤ-FITC/PI雙染技術(shù),結(jié)果顯示樣品A能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋
6、亡,20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml組的抑制率分別由陰性對(duì)照組的3.62%上升至9.14%、20.79%和31.53%,并且這種促凋亡作用具有濃度依賴性;
?、芙?jīng)流式PI單染技術(shù),結(jié)果顯示樣品A能夠使處于G0/G1期的細(xì)胞增多,減少?gòu)腉0/G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這種促凋亡作用具有濃度依賴性;
⑤經(jīng)Western blot免疫印跡技術(shù),結(jié)果顯示20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的
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