光遺傳學(xué)技術(shù)在眨眼條件反射研究中的初探.pdf

1、條件反射行為的研究歷史長(zhǎng)達(dá)一百年之久，其中眨眼條件反射行為是最簡(jiǎn)單，也是應(yīng)用最廣泛的聯(lián)合學(xué)習(xí)記憶模型之一。經(jīng)典的眨眼條件反射（Eyeblink conditioning, EBC）通常分為delay及trace兩種模式，一般而言，以外周刺激（如視覺(jué)或聽(tīng)覺(jué)刺激）作為條件刺激(Conditioned Stimulus, CS)來(lái)建立眨眼條件反射模型；同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)一些以電刺激外周視聽(tīng)信號(hào)上傳路徑所途經(jīng)（中繼）的局部腦區(qū)（或核團(tuán)）作為條件刺

2、激均成功建立了EBC的報(bào)告。已有研究提示前額葉在某些情況下參與了眨眼條件反射delay模式的建立或表達(dá)。這對(duì)傳統(tǒng)的結(jié)論----前額葉不參與 delay模式提出了挑戰(zhàn)，對(duì)此我們也非常感興趣，為什么在某些特殊情況下delay模式需要前額葉參與？因此，我們選擇了前額葉中分布最多的谷氨酸能神經(jīng)元作為研究靶點(diǎn)來(lái)探索谷氨酸能神經(jīng)元參與眨眼條件反射（delay模式）的神經(jīng)機(jī)制。
　　光遺傳學(xué)技術(shù)是通過(guò)基因工程的方法將目標(biāo)光通道敏感基因包裝到相關(guān)

3、病毒上，并將其轉(zhuǎn)染到動(dòng)物的某一類(lèi)神經(jīng)元上，在完成一系列的分子生物學(xué)過(guò)程后光敏蛋白最終表達(dá)在特定細(xì)胞的細(xì)胞膜上，同時(shí)依據(jù)不同的光敏蛋白（如ChR2）的不同特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)某一類(lèi)型細(xì)胞或神經(jīng)元精確至毫秒級(jí)的高分辨率調(diào)控的一門(mén)革命性技術(shù)。由于光遺傳學(xué)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，光遺傳學(xué)為我們驗(yàn)證 delay-EBC在某些情況下可能需要前額葉谷氨酸能神經(jīng)元參與的推測(cè)提供了目前為止最優(yōu)的方法。通過(guò) Pubmed的檢索，至今尚未發(fā)現(xiàn)以光刺激大腦內(nèi)某一類(lèi)神經(jīng)元作為CS并

4、成功建立 EBC的報(bào)告。由此，我們采用光遺傳學(xué)技術(shù)特異操控內(nèi)側(cè)前額葉（medial prefrontal cortex，mPFC）的谷氨酸能神經(jīng)元，并以光激活這一群谷氨酸能神經(jīng)元作為CS，從而探討此方式是否能成功建立delay-EBC及可能的內(nèi)在神經(jīng)機(jī)制。
　　材料和方法：通過(guò)立體定向注射手段，把攜帶有細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的視蛋白腺相關(guān)病毒 AAV2/8-CaMKIIα-ChR2-mCherry注射到mPFC。病毒注射3~4周后，一方

5、面通過(guò)熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡來(lái)判斷神經(jīng)元膜表面是否表達(dá)有紅色熒光蛋白,以及其表達(dá)位置是否在mPFC，從而判斷光敏基因在谷氨酸能神經(jīng)元表達(dá)的特異性。并利用在體細(xì)胞外記錄技術(shù)觀察表達(dá)AAV2/8-CaMKIIα-ChR2-mCherry的谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)不同光刺激頻率的反應(yīng)特性，用以了解ChR2的通道生理功能，為行為學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。另一方面經(jīng)操控已經(jīng)表達(dá)在自由活動(dòng)動(dòng)物 mPFC谷氨酸能神經(jīng)元上的 ChR2通道完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：待病毒AA

6、V2/8-CaMKIIα-ChR2-mCherry靶向注射到大鼠右側(cè)mPFC4周后通過(guò)手術(shù)建立光神經(jīng)界面，并預(yù)留打藥孔，分別用藍(lán)光（470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬，20 Hz）激活mPFC谷氨酸能神經(jīng)元作為CS，電刺激眼輪匝肌作為US，觀察是否能建立delay-EBC；待條件行為建立完成后以微注射技術(shù)向 mPFC光照射部位注射短時(shí)失活藥物muscimol（GABA-A受體激動(dòng)劑，氯離子通道開(kāi)放導(dǎo)致氯離子大量進(jìn)入細(xì)胞而達(dá)

7、到失活細(xì)胞的目的），觀察對(duì)delay-DEC的影響。
　　結(jié)果：（1）病毒成功注射到mPFC，94.6±0.9％的CaMKIIα表達(dá)的谷氨酸能神經(jīng)元表達(dá)ChR2-mCherry蛋白，并且表達(dá)ChR2-mCherry蛋白的細(xì)胞98.87±0.3%是谷氨酸能神經(jīng)元，提示在 CamKⅡα啟動(dòng)子控制下，腺相關(guān)病毒載體可將光敏基因特異性的表達(dá)于谷氨酸能神經(jīng)元（2）表達(dá)有ChR2-mCherry蛋白的谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)藍(lán)光（470 nm,20

8、mW/mm2,5 ms波寬，5~80 Hz）產(chǎn)生穩(wěn)定的反應(yīng)，對(duì)低頻光刺激（5、10和20Hz）的反應(yīng)性優(yōu)于高頻光刺激（40和80Hz）。（3）以藍(lán)光（470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬，20 Hz）激活mpfc谷氨酸能神經(jīng)元為CS的條件下，大鼠能成功建立眨眼條件反射行為，通過(guò)靶向微注射muscimol能明顯影響delay-EBC的條件反應(yīng)（conditioned response，CR）的表達(dá)。
　　結(jié)論：通過(guò)一系列