普魯士藍(lán)聯(lián)合血液灌流治療急性鉈中毒——特異性巰基化合物及神經(jīng)遞質(zhì)的研究.pdf

1、目的：
　　采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定急性鉈中毒犬經(jīng)不同方法治療后血漿中谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及腦組織中興奮性、抑制性氨基酸含量的變化，進(jìn)一步探究體內(nèi)鉈與巰基結(jié)合，引起脂質(zhì)過氧化以及神經(jīng)毒性損害的機(jī)制，為急性鉈中毒治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、動(dòng)物模型:24只比格犬隨機(jī)分成4組，雌雄各半(n=6)，分別為染毒對(duì)照組、普魯士藍(lán)治療組(PB)、血液灌流治療組（HP）以及普魯士藍(lán)聯(lián)合血液灌

2、流治療組(PB+HP)，各組均給予硝酸亞鉈(TlNO3)半數(shù)致死劑量（LD50=45 mg/kg）灌胃染毒，對(duì)照組染毒后不做任何處理;PB組于首次染毒后4小時(shí)給予普魯士藍(lán)灌胃，劑量為467mg/kg/d，分3次，連續(xù)5日;HP組染毒后4小時(shí)開始進(jìn)行血液灌流，每次2小時(shí)，每日1次，連續(xù)5日;PB+HP組染毒后4小時(shí)給予PB組聯(lián)合HP組的處理方式;期間觀察動(dòng)物體重，精神狀態(tài)，飲食情況變化，10日后處死，分離并留取不同腦區(qū)腦組織。2、高效液相

3、色譜法測(cè)定血漿中谷胱甘肽及半胱氨酸的含量:4組動(dòng)物分別進(jìn)行染毒前及染毒后1h、2h、4h、6h、8h、12h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192h、216h、240 h采血1ml，冰浴，立即離心，取上清，以青霉胺為內(nèi)標(biāo)，DTNB為衍生化試劑，衍生化處理后，采用高效液相色譜—紫外(HPLC-UV)法，色譜柱為ZORBAXSB-C18(4.6×250 nm，5μm)，流動(dòng)相:A0.05 mol

4、/L乙酸鈉緩沖液(pH=5.6)-甲醇(90∶10);B甲醇-水(90∶10)，甲醇梯度洗脫，流速:1 ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm，檢測(cè)血漿中谷胱甘肽和半胱氨酸的含量，剩余血漿置于-79℃，以便日后測(cè)定。3、高效液相色譜法測(cè)定腦組織中興奮性及抑制性氨基酸的含量:觀察10日后麻醉處死動(dòng)物，分別取腦組織的皮質(zhì)、紋狀體、海馬、下丘腦、小腦及腦干各0.1g，按質(zhì)量/體積之比1∶10加入0.1 mol/L的高氯酸，勻漿機(jī)冰浴

5、勻漿后加入冷凍離心機(jī)(4℃，16000 r，15 min)，離心后取上清液500μ l，用1 mol/L的氫氧化鈉將組織液調(diào)pH=9，定容至1ml，以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生化試劑，采用高效液相色譜—熒光(HPLC-FLU)法，色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6×250 nm，5μm)，流動(dòng)相為B0.1 mol/L磷酸二氫鈉-0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)（用磷酸調(diào)至pH=4.5）:甲醇(85∶15)，A純乙腈

6、;乙腈梯度洗脫，流速1 ml/min，柱溫26℃，波長(zhǎng):230/450 nm，熒光檢測(cè)器檢測(cè)腦組織中興奮性及抑制性氨基酸含量。
　　結(jié)果：
　　建立高效液相色譜法測(cè)定血漿中谷胱甘肽及半胱氨酸模型，GSH、Cys及青霉胺分別在2.9 min、4.0 min及9.0 min被分離出，峰型良好，分離度高。
　　GSH在0.714～14.286μg/ml范圍內(nèi)，線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=15.153X+8.043，相關(guān)系數(shù)為

7、0.9993;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜7.61％;日內(nèi)精密度＜8.422，日內(nèi)回收率100.38％～103.47％;日間精密度＜8.518％，日間回收率98.16％～104.11％。
　　Cys在0.714～14.286μg/ml范圍內(nèi)，線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=17.813X+653.89，相關(guān)系數(shù)為0.9994;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜8.01％;日內(nèi)精密度＜5.965％，日內(nèi)回收率97.41％～101.48％;日間精密度＜7.611％

8、，日間回收率99.79％～108.68％。
　　建立高效液相色譜法測(cè)定腦組織中Asp、Glu、Gly及GABA模型，Asp、Glu、Gly及GABA分別在3.5 min、5.0 min、5.6 min及18.4 min被分離出，峰型良好，分離度高。Asp在25～500μg/ml范圍內(nèi)，線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=373.95X+3654.60，相關(guān)系數(shù)為0.9998;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜8.965％;日內(nèi)精密度＜7.526％，日內(nèi)回

9、收率99.68％～105.69％;日間精密度＜7.806％，日間回收率94.78％～97.33％。
　　Glu在25～500μg/ml范圍內(nèi)，線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=343.83X+1575.80，相關(guān)系數(shù)為0.9994;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜6.512％;日內(nèi)精密度＜7.308％，日內(nèi)回收率97.80％～101.50％;日間精密度＜7.599％，日間回收率95.50％～107.50％。
　　Gly在25～500μg/ml范

10、圍內(nèi)，線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=989.64X+4972.90，相關(guān)系數(shù)為0.9995;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜5.793％;日內(nèi)精密度＜5.653％，日內(nèi)回收率98.57％～107.67％;日間精密度＜6.632％，日間回收率98.23％～104.64％。
　　GABA在25～500μg/ml范圍內(nèi)，線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=697.23X+4612.40，相關(guān)系數(shù)為0.9997;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜7.925％;日內(nèi)精密度＜8.0

11、18％，日內(nèi)回收率98.86％～109.46％;日間精密度＜8.890％，日間回收率92.66％～104.34％。
　　急性鉈中毒染毒對(duì)照組、PB組、HP組及PB+HP之間，血漿GSH及Cys濃度均存在差異，主體內(nèi)效應(yīng)檢驗(yàn)P值均＜0.05，說明不同時(shí)間點(diǎn)GSH及Cys濃度依據(jù)分組不同存在差異;主體間效應(yīng)檢驗(yàn)P值均＜0.05，說明各治療組與對(duì)照組之間GSH以及Cys濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中普魯士藍(lán)聯(lián)合血液灌流組下降最為明顯。

12、　　PB組、HP組及PB+HP組與染毒對(duì)照組比較，皮層、下丘腦及海馬區(qū)Asp及Glu含量存在差異，P值均＜0.05，其余腦區(qū)無明顯變化。PB組、HP組及PB+HP組與染毒對(duì)照組比較，各腦區(qū)抑制性氨基酸含量變化不明顯。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC測(cè)量血漿GSH及Cys含量方法及HPLC測(cè)量腦組織中Asp、Glu、Gly及GABA方法精確靈敏，穩(wěn)定性高，可用于鉈中毒犬血漿中GSH、Cys及腦組織中四種氨基酸的快速檢測(cè)。

13、犬急性鉈中毒后血漿GSH及Cys均出現(xiàn)明顯下降，經(jīng)PB、HP及二者聯(lián)合治療后下降程度降低，PB+HP組最為明顯。急性鉈中毒犬各腦區(qū)EAA及IAA含量不等，犬經(jīng)PB、HP及二者聯(lián)合治療后，皮層、下丘腦及海馬EAA含量較中毒對(duì)照組均有所下降，PB+HP組下降最為明顯，IAA無明顯變化。綜合分析提示GSH、Cys與EAA在急性鉈中毒致病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用，PB、HP及PB+HP治療均有效，PB+HP效果最為明顯，可能是救治急性鉈中毒最為理想