白色海綿狀斑痣一家系角蛋白13基因突變位點(diǎn)研究.pdf

1、目的：
　　尋找白色海綿狀斑痣（white sponge nevus，WSN）家系角蛋白K13（keratin13，K13或KRT13）基因突變，研究角蛋白13基因（k13）突變位點(diǎn)對(duì)K13在組織與細(xì)胞中表達(dá)水平的影響。
　　方法：
　　收集一個(gè)WSN家系，此家系現(xiàn)存9人，WSN患者2人。抽取該家系中5人外周靜脈血各5ml作為實(shí)驗(yàn)組，另抽取3名健康人外周靜脈血各5ml作為對(duì)照組，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后基因組測(cè)序，以NCBI數(shù)

2、據(jù)庫(kù)人標(biāo)準(zhǔn)堿基序列作對(duì)比，分析基因突變位點(diǎn)。
　　應(yīng)用免疫組化技術(shù)，檢測(cè)該家系中患者口腔黏膜組織中K13表達(dá)水平，以人正常口腔黏膜組織、口腔白斑組織做對(duì)照，進(jìn)行分析對(duì)比。
　　以RNAi慢病毒為工具，針對(duì)k13基因構(gòu)建突變載體，感染人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT），構(gòu)建角蛋白 k13基因敲減與角蛋白 k13基因c.T3222C(p.L409P)突變細(xì)胞模型，和未經(jīng)處理的人永生化表皮細(xì)胞做對(duì)照，運(yùn)用WB技術(shù)檢測(cè)該模型細(xì)胞中角蛋白

3、K13的表達(dá)水平，運(yùn)用MTT細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)模型細(xì)胞的增殖效率。
　　結(jié)果：
　　WSN患者與正常人群DNA序列分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，經(jīng)家系分析及對(duì)照組分析初步將c.T3222C(p.L409P)確定為致病基因。該家系中2例患者口腔黏膜組織角蛋白K13在棘細(xì)胞層表達(dá)水平較正常人降低（p＜0.05）。細(xì)胞模型構(gòu)建實(shí)驗(yàn)中，k13基因敲減模型細(xì)胞中角蛋

4、白K13無(wú)表達(dá)，k13基因c.T3222C(p.L409P)突變細(xì)胞模型中角蛋白K13表達(dá)水平較空白對(duì)照組降低。MTT細(xì)胞檢測(cè)表明，兩組模型中細(xì)胞的增殖效率均較空白對(duì)照組提高。證實(shí)k13基因c.T3222C(p.L409P)突變是導(dǎo)致WSN的原因。
　　結(jié)論：
　　本研究所收集的WSN家系患者k4、k13基因存在10個(gè)單核苷酸多態(tài)性，其中k13基因c.T3222C(p.L409P)為致病基因。細(xì)胞水平研究顯示W(wǎng)SN患者k13