歐前胡素和異歐前胡素的體內(nèi)外代謝研究.pdf

1、歐前胡素（Imperatorin，IMP）和異歐前胡素（Isoimperatorin，ISOIMP）是呋喃香豆素類活性物質(zhì)，二者互為同分異構(gòu)體。它們廣泛存在于白芷、獨(dú)活和北沙參等傘形科藥用植物中，是這些中藥的主要藥效成分，也是藿香正氣水，龍葵銀消片和元胡止痛片等多種臨床廣泛使用的中藥制劑的重要活性成分，具有消炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抗菌抗病毒等藥理活性。
　　本課題以IMP及其活性代謝產(chǎn)物獨(dú)活素（Heraclenin，HER）、花椒毒酚（

2、Xanthotoxol，XANT），ISOIMP及其活性代謝產(chǎn)物氧化前胡素（Oxypeucedanin，OPE）和水合氧化前胡素（Oxypeucedanin hydrate，OPEH）為研究對(duì)象，建立并驗(yàn)證了同時(shí)檢測(cè)生物樣品中6種呋喃香豆素類活性成分的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）方法。在此基礎(chǔ)上，開展IMP和ISOIMP的大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究，尿液、糞便和膽汁排泄研究以及組織分布研究，同時(shí)考察代謝產(chǎn)物的生成動(dòng)力學(xué)和排泄。在體

3、外肝微粒體和重組人源CYP酶孵育體系中，研究了IMP和ISOIMP肝微粒體代謝消除動(dòng)力學(xué)、酶動(dòng)力學(xué)和 CYP酶代謝表型，為IMP和ISOIMP的進(jìn)一步開發(fā)、以及臨床安全有效用藥提供指導(dǎo)和依據(jù)。
　　本課題首先建立了LC-MS/MS定量檢測(cè)方法，樣品處理采用蛋白沉淀法，以茴芹內(nèi)酯（Pimpinellin，PIM）為內(nèi)標(biāo)，采用CAPCELL PAK MG II C18（2.0×100mm，3μm）色譜柱，以乙腈（0.1％甲酸）-水（0

4、.1%甲酸，5mM甲酸銨）梯度洗脫方式，有效分離了原型化合物和代謝產(chǎn)物。應(yīng)用Agilent6410B型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，在電噴霧離子源、正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)化合物進(jìn)行定量分析。生物樣品的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法在2-2000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.9900）、最低定量限（Lower limit of quantitation，LLOQ）為2ng/mL，回收率大于90%，準(zhǔn)確度（RE%）和精密

5、度（RSD%）小于±15%，基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性能滿足藥代動(dòng)力學(xué)的要求。此方法快捷簡(jiǎn)便，適用于大量樣品的快速分析。
　　大鼠單次灌胃30mg/kg IMP后，原藥的血漿濃度在1 h達(dá)到峰值，隨后迅速消除，t1/2為1.5h，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）為5078±3512ng·h·mL-1，血漿中檢測(cè)到代謝產(chǎn)物HER和XANT；大鼠靜脈注射2mg/kg IMP后，原藥代謝消除迅速，t1/2為0.99h，AUC為731.2±67.

6、3ng·h·mL-1，血漿樣品中僅檢測(cè)到產(chǎn)物HER，大鼠口服IMP的絕對(duì)生物利用度為46.3%。大鼠單次灌胃10mg/kg ISOIMP后，原藥的血藥濃度在0.8h達(dá)峰，t1/2為1.7h，AUC為396.3±200.5ng·h·mL-1；靜注2mg/kg ISOIMP后，原藥在血漿迅速消除，t1/2為0.59h，AUC為429.±72.1ng·h·mL-1；灌胃和靜注給藥血漿中均能檢測(cè)到代謝產(chǎn)物OPE和OPEH，大鼠口服ISOIMP的

7、絕對(duì)生物利用度為18.4%。
　　大鼠灌胃30mg/kg IMP后，原藥在尿液、糞便和膽汁的72 h累積排泄率分別為0.018%、1.16%和0.0085%，尿糞總排泄率為1.18%，提示IMP在大鼠體內(nèi)發(fā)生廣泛的代謝，主要以產(chǎn)物形式排泄；產(chǎn)物HER的尿、糞和膽汁排泄量極少；XANT以游離、葡萄糖萄醛酸和硫酸結(jié)合物的形式從尿液和膽汁排出，72h的尿和膽汁累積排泄率分別為0.98%和5.75%，但糞便中未檢測(cè)到XANT。大鼠灌胃30

8、mg/kg ISOIMP后，原藥在尿液和膽汁中的排泄量極低，而糞便的72 h累積排泄率為34.7%，提示其口服吸收不完全；產(chǎn)物OPEH以原型、葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合物的形式從尿液、糞便和膽汁中排出，72h的累積排泄率分別為0.033%、0.054%和0.68%；另一產(chǎn)物 OPE在尿、糞和膽汁中的排泄量很低。上述結(jié)果表明，本課題檢測(cè)的活性產(chǎn)物都不是主要的排泄產(chǎn)物，IMP和ISOIMP在體內(nèi)可能轉(zhuǎn)化成其它產(chǎn)物后排泄。
　　大鼠灌胃10m

9、g/kg IMP后，分別于0.5h、2h和6h取心、肝、脾、肺、腎和腦等重要組織器官，測(cè)定藥物的組織濃度。結(jié)果表明，IMP能迅速并廣泛地分布到組織器官中，大部分組織的藥物濃度在0.5h達(dá)到峰值，組織和血漿的藥物濃度由高到低的排序是：肝＞腎＞心＞腦＞肺＞脾＞血漿，其中肝臟的分布濃度顯著高于血漿和其它組織。大鼠灌胃10mg/kg ISOIMP后，大部分組織的藥物濃度在2h時(shí)達(dá)到最高，各組織和血漿藥物濃度由高到低的排序是：肝＞腎＞心＞腦＞脾＞

10、肺＞血漿，肝臟中的藥物暴露水平顯著高于血漿和其它組織。
　　在人和大鼠肝微粒體中，IMP和ISOIMP主要發(fā)生CYP酶介導(dǎo)的I相代謝消除。IMP在人和大鼠肝微粒體30min的代謝轉(zhuǎn)化率分別為69.7%和94.5%，消除半衰期t1/2分別為（18.9±0.6）和（2.85±0.37）min，經(jīng)外推得到的肝臟清除率CLh是（16.9±0.1）和（51.9±0.4）mL·min-1·kg-1，肝微粒體表觀酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km分別為（13.6

11、±0.16）和（14±0.24）μmol/L，Vmax分別為（2928±96）和（8434±27）nmol·min-1·g-1。ISOIMP在人和大鼠肝微粒體10 min的代謝轉(zhuǎn)化率分別為82.7%和96.6%，t1/2分別為（4.94±0.31）和（2.27±0.25）min，CLh為（19.6±0.1）和（52.6±0.3）mL·min-1·kg-1；表觀Km分別為（15.2±0.6）和（16.7±0.4）μmol/L，Vmax分別

12、為（3677±105）和（11423±371）nmol·min-1·g-1。肝微粒體代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，IMP和ISOIMP在人和大鼠肝微粒體中的代謝消除迅速，且大鼠的代謝速率高于人；ISOIMP的代謝消除比IMP快，這可能也是ISOIMP絕對(duì)生物利用度低于IMP的原因之一。
　　代謝表型研究表明，IMP和ISOIMP在肝微粒體的I相代謝是由多個(gè)CYP同工酶介導(dǎo)的，CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19和CYP3A4是參與兩個(gè)

13、活性化合物代謝的主要同工酶，經(jīng)整體歸一化法得到它們對(duì)IMP的代謝貢獻(xiàn)率分別是20.4%、7.3%、10.5%和61.8%，對(duì)ISOIMP的代謝貢獻(xiàn)率分別是34.8%、18.3%、13.6%和33.4%。
　　綜上所述，IMP和ISOIMP在大鼠口服吸收快，可在肝臟分布富集，暴露水平顯著高于血漿和其它組織，它們代謝消除迅速，主要經(jīng)CYP酶介導(dǎo)代謝，以代謝產(chǎn)物的形式排泄。IMP和ISOIMP的體內(nèi)代謝清除快、消除半衰期短，藥物開發(fā)需考