成骨不全致病基因突變及Ⅰ型膠原蛋白基因甲基化分析.pdf

1、成骨不全（Osteogenesis imperfecta，OI），是一種遺傳性結締組織疾病，其特點通常表現(xiàn)為多發(fā)性骨折、低骨密度，其他臨床癥狀還包括長期骨折引起的骨骼畸形，脊柱側凸，藍鞏膜，牙本質(zhì)發(fā)育不全，皮膚彈性下降，關節(jié)和韌帶松弛等。成骨不全是遺傳性的罕見病，發(fā)病率很低，在兒童中發(fā)病率大約為1/12000-15000。成骨不全具有表型及遺傳異質(zhì)性，有常染色體顯性遺傳以及常染色體隱性遺傳兩種遺傳方式。根據(jù)臨床表型以及致病基因，成骨不全

2、迄今分為15個亞型。約90％的患者是由于Ⅰ型膠原蛋白結構個基因COL1A1、COL1A2突變而引起。常染色體隱性遺傳所占患者數(shù)量少，但致病基因種類眾多，包括SERPINF1、 CRTAP、 LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、S P7、BMP1、TMEM38B、WNT1、CREB3L1以及成骨不全與Brcuk綜合征等致病基因P LOD2共12種。
　　研究目的：
　　對文獻已報道的成骨不全臨床樣本進行常染

3、色體顯性遺傳以及常染色體隱性遺傳等共15個致病基因進行突變檢測。
　　研究方法：
　　經(jīng)山東省醫(yī)學科學院倫理委員會批準，采集110例成骨不全患者靜脈血和臨床信息。提取外周靜脈血基因組 DNA，利用實驗室前期建立的檢測方法，采用 Touch-down PC R方法進行目的基因片段的擴增。實驗首先篩選的是COL1A1與COL1A2基因，若二者未發(fā)生突變，則進行12種常染色體隱性致病基因的篩選以及骨質(zhì)疏松相關基因 PLS3的檢測。

4、PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Sanger測序后通過Mutation Survery軟件分析變異位點，并通過PolyPhen, Mutation Taster、Align GVGD與SIFT軟件預測變異對蛋白質(zhì)功能的影響。進一步通過I型膠原蛋白突變數(shù)據(jù)庫、人類突變數(shù)據(jù)庫與dbSNP等篩選變異位點，進而識別突變位點。同時初步探討突變與臨床表型之間的關系。
　　結果：
　　在110例成骨不全患者中，篩選到COL1A1/COL1A2基因突變63

5、例，IFITM5突變患者7例， SERPINF1突變2例，WNT1突變5例者。未檢測到突變患者33例。
　　COL1A1/COL1A2基因變異位點合計79個，多存在于三螺旋區(qū)，其中36個為新發(fā)變異，尚有待于進一步通過健康人群篩查是否為致病突變位點。COL1A1/COL1A2突變主要為錯義突變，特別是甘氨酸的替換，約占替換氨基酸的58%，且以甘氨酸被絲氨酸替代的比率為最高。突變具有外顯子偏好性，COL1A1基因的第8號外顯子，以及C

6、OL1A2基因的17、19、38號外顯子區(qū)域均為突變頻率高發(fā)區(qū)。此外，在COL1A1的致死突變區(qū)（p.869-1001）發(fā)現(xiàn)5個突變，COL1A2的致死突變區(qū)（p.409-454，p.637-670，p.712-727， p.847-901，p.949-997）發(fā)現(xiàn)6個突變位點。7例 V型成骨不全患者均發(fā)現(xiàn) IFITM5 c.-14C>CT雜合突變，該7例患者臨床表型均為嚴重型，骨骼創(chuàng)傷后容易形成肥大的增生性愈傷組織。
　　2例成

7、骨不全患者均為SERPINF1復合雜合突變， c.167C>CG+c.215C>CT復合雜合突變患者為嚴重的III型，c.215C>CT+c.907C>CT雜合突變患者臨床癥狀相對較輕。5例成骨不全患者為WNT1突變，其中2個為純合缺失，其余為雜合突變。患者具有眼瞼下垂表型，個別患者還有精神亢奮的表現(xiàn)。
　　結論：
　　對110例臨床成骨不全患者進行了基因檢測，其中77例患者檢測到致病基因突變位點，絕大部分為COL1A1與C