HGPRT基因敲減醫(yī)學(xué)模型兔的初步研究.pdf

1、哺乳動物體細(xì)胞核移植技術(shù)的出現(xiàn)使得利用長時間體外培養(yǎng)的細(xì)胞系獲得克隆動物成為可能，其與轉(zhuǎn)基因技術(shù)的結(jié)合為醫(yī)學(xué)研究提供了新的機(jī)遇和方法。 本試驗主要致力于HGPRT基因敲減醫(yī)學(xué)模型兔的研究。主要包括以下兩部分內(nèi)容: (1) 將pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔成纖維細(xì)胞，利用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)法獲得來源于單個轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞克隆,然后以轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植，并利用PCR及多重PCR技術(shù)鑒定篩選獲

2、得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆及其核移植單個胚胎中整合的NeoR基因和β-actinDNA。證實利用條件性培養(yǎng)液及適當(dāng)增加細(xì)胞密度可提高轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞的篩選效率，以及利用多重PCR技術(shù)可快速準(zhǔn)確的鑒定少量轉(zhuǎn)基因胚胎中的外源基因。 （2）構(gòu)建了針對HGPRT基因表達(dá)的shRNA干擾載體，并轉(zhuǎn)染兔成纖維細(xì)胞，獲得攜帶該干擾片段的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。經(jīng)PCR鑒定轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞克隆陽性率為83.3％。RT-PCR及Western-blot檢測結(jié)果表