二肽基肽酶4在常染色體顯性多囊腎病發(fā)病中的機(jī)制與作用研究.pdf

1、目的：
　　常染色體顯性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是人類發(fā)病率最高的單基因遺傳性腎臟病。接受替代治療的終末期腎病(ESRD)中7～10％是ADPKD患者。盡管在發(fā)現(xiàn)此病500年來進(jìn)行了大量的研究，直至今日仍然無法治愈且對其機(jī)制尚不明了。所有人種皆不能幸免于ADPKD，7～10％的ESRD因此而起。全球范圍，接受腎臟替代治療（RRT）的第四大原因就

2、是ADPKD。在不同的國家，ADPKD導(dǎo)致的ESRD發(fā)病率有所不同，在日本是每年百萬分之4.8，在美國是每年百萬分之7.9，歐洲各國每年百萬分之3.9到15.3。
　　在丹麥哥本哈根和美國奧姆斯特德進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查顯示，80歲以下人口中，ADPKD的患病率是400到1000分之一。此后在歐洲和日本進(jìn)行的其他研究顯示不同地區(qū)ADPKD患病率波動(dòng)于543到4000分之一。鑒于上述研究地理位置、觀測時(shí)間、采樣方法、診斷標(biāo)準(zhǔn)、家系調(diào)查、

3、人口多寡都有不同，故而差異雖大尚可理解。然則，來自尸檢報(bào)告的數(shù)據(jù)要高于1/500，為1/339～1/492。這說明大量患者終其一生未能確診。
　　ADPKD由多囊腎病基因1(Polycystic kidney disease1 gene，PKD1)和多囊腎病基因2（Polycystic kidney disease2 gene，PKD2）兩個(gè)基因突變造成，此二基因分別編碼多囊蛋白-1(Polycystin-1，PCl)及多囊蛋白-

4、2(Polycystin-2，PC2)。其中PKD1突變的患者占80～85％，PKD2突變的患者占15～20％。所謂PKD3，經(jīng)過對相關(guān)病例的重新分析，已經(jīng)基本排除了其存在的可能性。
　　PC1與PC2在腎小管上皮細(xì)胞初級纖毛上相互作用構(gòu)成復(fù)合體，后者屬于瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）家族中的一種非選擇性鈣離子滲透通道。PC1的C末端結(jié)構(gòu)域可以易位至細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，并充當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄的共

5、激活劑。PC1和PC2在纖毛經(jīng)受機(jī)械刺激時(shí)引發(fā)Ca2+瞬間內(nèi)流。
　　ADPKD的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，有前途的治療方法主要集中于通過阻斷過度活化mTOR通路和cAMP通路來延緩疾病進(jìn)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑（依維莫司和西羅莫司）改善嚙齒類動(dòng)物模型囊性腎病的效果非常顯著，但依維莫司和西羅莫司都是強(qiáng)效的免疫抑制劑，可能帶來致命的副作用，且臨床試驗(yàn)并未取得良好的療效。所以我們需要探索更為安全有效的手段。
　　大量報(bào)道證實(shí)AMP

6、活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)下調(diào)是mTOR通路過度活化的原因之一，通過上調(diào)AMPK水平可以抑制過度活化的mTOR通路，并在動(dòng)物模型中取得了良好的效果。通過抑制二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase4，DPP4)的活性可以上調(diào)AMPK水平是毫無疑問的，但能否抑制過度激活的mTOR通路改善ADPKD，ADPKD患者和動(dòng)物模型中是否存在DPP4過表達(dá)從而過度激活了mTOR通

7、路，這兩個(gè)問題尚無解答。
　　本課題的目的是觀察ADPKD患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織中DPP4是否存在表達(dá)上調(diào)，以及使用DPP4抑制劑，是否能同過上調(diào)AMPK，抑制mTOR活性，達(dá)到治療ADPKD的目的。
　　方法：
　　1、DPP4在ADPKD患者及動(dòng)物模型中的表達(dá)水平檢測:搜集ADPKD患者腎組織與移植供腎組織標(biāo)本，用western blot技術(shù)測定兩者的DPP4蛋白表達(dá)量，并進(jìn)行比較;繁育多囊腎模型Han: SPRD大

8、鼠，鑒定出野生型(WT)和發(fā)病模型(cy-/+)，正常飼養(yǎng)至12周，取腎組織，采用western blot測定DPP4蛋白表達(dá)量，進(jìn)行比較。
　　2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抑制DPP4活性:干預(yù)藥物包括AMPK激活劑二甲雙胍(Metformin)，DPP4抑制劑維格列汀(Vildagliptin)和利格列汀(Linagliptin)。繁育多囊腎模型Han: SPRD大鼠，出生后鑒定出野生型(WT)和發(fā)病模型(cy-/+)。將發(fā)病模型大鼠分為

9、對照組（Ctrl）以及二甲雙胍(MET)組、維格列汀(VIG)組、利格列汀(LIG)組。后3組大鼠自出生后4周給藥，于第4/8/12周取血查腎功能，第12周代謝籠測24小時(shí)尿量，并處死動(dòng)物，取雙腎測腎重體重比，提取蛋白，送病理行全片掃面。
　　3、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察抑制DPP4活性對細(xì)胞增殖的影響:采用人腎囊腫襯里上皮細(xì)胞株WT9-12進(jìn)行培養(yǎng)。以MTT方法觀察在不同濃度的二甲雙胍、維格列汀、利格列汀作用下，24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)

10、細(xì)胞增殖情況。
　　4、抑制DPP4活性治療ADPKD的機(jī)制研究:取不同濃度二甲雙胍、維格列汀、利格列汀處理的WT9-12細(xì)胞，Western blot技術(shù)分析干預(yù)后AMPK的蛋白含量變化。取前述實(shí)驗(yàn)提取WT、Ctrl、MET、VIG、LIG組大鼠腎組織蛋白，用westem blot技術(shù)測定AMPK、Akt、p70S6K蛋白含量。
　　結(jié)果：
　　1、ADPKD患者腎臟組織中DPP4的表達(dá)量顯著高于移植供腎(1.97v

11、s.0.60，P=0.002)，升高了大約3倍。多囊腎模型大鼠(cy-/+)腎臟中情況類似，發(fā)病的模型大鼠腎臟中DPP4表達(dá)量升高了接近3倍(7.49vs1.14，P=0.001)。
　　2、與對照組相比，二甲雙胍、維格列汀和利格列汀均可顯著降低Han:SPRD大鼠腎重體重比(KW/BW)、囊腫指數(shù)，改善腎功能。3組給藥組之間上述指標(biāo)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、二甲雙胍、維格列汀、利格列汀都可以抑制WT9-12的增殖。三種藥物

12、都存在濃度依賴性，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)50nM濃度的二甲雙胍對WT9-12細(xì)胞的增長抑制率分別為34％，60％，74％;20nM維格列汀對WT9-12細(xì)胞的增長抑制率分別為14％，20％，28％;1nM利格列汀對WT9-12細(xì)胞的增長抑制率分別為79％，86％，93％。
　　4、經(jīng)給藥后，給予二甲雙胍、維格列汀、利格列汀的模型大鼠腎組織中pAMPK的表達(dá)均顯著高于Ctrl組(P＜0.001)，分別升高了2.7

13、倍、3.5倍和5倍;而且維格列汀組顯著高于二甲雙胍組(3.5vs.2.7，P＜0.001)，而利格列汀組又顯著高于維格列汀組(5.1vs2.7，P＜0.001)。和對照組相比，二甲雙胍(4.5vs5.1，P=0.029)、維格列汀(3.9vs5.1，P＜0.001)、利格列汀(3.0vs5.1， P＜0.001)都可以使模型大鼠腎組織中過度活化的mTOR被抑制，下游產(chǎn)物p70S6K表達(dá)量顯著下降;維格列汀組p70S6K蛋白表達(dá)量低于二甲