靶向抑制EBV-LMP1對NK-T細(xì)胞淋巴瘤放射增敏及抑制侵襲力的作用研究.pdf

1、研究背景與研究目的：
　　結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤—鼻型（extranodal natural killer t cell lymphoma,nasal type以下簡稱NKTCL）屬于非霍奇金淋巴瘤，是一類以血管中心性壞死為特點(diǎn)的淋巴瘤，好發(fā)于東亞及南美洲。放射治療仍為NKTCL特別是局限期NKTCL的主要治療方案，然而仍有30％的患者治療效果較差，因?yàn)槟壳皩υ摬∪狈τ杏玫念A(yù)測放射敏感性的生物學(xué)指標(biāo)，探究能夠預(yù)測放射敏感性的分子標(biāo)

2、記值得我們進(jìn)一步研究。
　　NKTCL病因尚不明確，但EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）的感染同該惡性淋巴瘤的發(fā)病關(guān)系密切。EB病毒編碼的LMP1（latent membrane protein,LMP1）基因是被證實(shí)的的致癌基因，LMP1可在大多數(shù)鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中表達(dá)，因此目前LMP1的研究已成為EBV相關(guān)惡性腫瘤特別是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤研究的熱點(diǎn)。特異性地阻斷LMP1基因相當(dāng)于去除EB

3、V的致癌因素，這種治療方式已經(jīng)成為EBV相關(guān)腫瘤基因治療的研究方向之一。然而這種治療方式在EBV相關(guān)淋巴瘤特別是NKTCL中的研究較少，LMP1基因?qū)KTCL放射敏感性的影響及其分子機(jī)制尚無研究。
　　在本課題中，我們選擇LMP1作為NKTCL基因治療的分子靶點(diǎn)，研究利用shRNA干擾技術(shù)沉默LMP1基因表達(dá)來增加EBV相關(guān)淋巴瘤放射敏感性的可行性。我們首先在NKTCL患者組織標(biāo)本和細(xì)胞系檢測LMP1的表達(dá)情況，然后構(gòu)建攜帶LM

4、P1cDNA和LMP1shRNA的重組慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染NKTCL細(xì)胞株。研究沉默LMP1對NKTCL生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及放射敏感性等生物學(xué)特性的作用，最后檢測凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及DNA損傷修復(fù)相關(guān)分子通路基因，探索LMP1在NKTCL中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，為NKTCL的臨床診治提供分子靶標(biāo)。
　　第一部分：LMP1在NK/T細(xì)胞淋巴瘤的差異表達(dá)水平及對其放射敏感性的關(guān)系
　　目的：
　　從mRNA和蛋白水平檢測LM

5、P1在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織、細(xì)胞中的表達(dá)水平，并探討其與放療療效的關(guān)系。
　　材料與方法：
　　1．收集2013年9月-2015年3月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者組織活檢新鮮標(biāo)本40例。檢測組織標(biāo)本中LMP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，根據(jù)放射治療療效將患者分為敏感、中度敏感和不敏感組三組。分析LMP1的表達(dá)水平與臨床病理特征及放療療效的關(guān)系。另取良性淋巴組織反應(yīng)性增生標(biāo)本20例作為對照。
　　2．

6、RT-PCR及Western blot檢測在SNK-6、NKL、NK92、YTS及YT共5個NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中LMP1基因及蛋白的內(nèi)源性表達(dá)。6MV-X射線分別給予0、2、4、6、8Gy的劑量進(jìn)行放射治療，CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，摸索合適的放療劑量，細(xì)胞學(xué)水平探索LMP1與放射敏感性差異的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1．40例NKTCL患者病灶組織中34例RT-PCR檢測到LMP1mRNA，陽性率8

7、5%。對34例患者組織RT-PCR及Western blot發(fā)現(xiàn)，NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中LMP1mRNA和蛋白相對表達(dá)量均明顯高于良性淋巴組織反應(yīng)性增生組織(F=248.367，P<0.001)。LMPl表達(dá)水平與NKTCL的血清β2-微球蛋白、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、B癥狀密切相關(guān)，即β2-微球蛋白異常、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴隨B癥狀者，LMPl表達(dá)水平高(P<0.01)。單純放療組LMPl表達(dá)水平與放療療效密切相關(guān)，即LMP1表達(dá)水平越高者，放療效

8、果越差(P<0.05)。
　　2．熒光實(shí)時定量PCR檢測EBV-LMP1在SNK-6、NKL、YT、YTS、NK-92細(xì)胞系中的表達(dá)。以NKL細(xì)胞的表達(dá)為參照組，對結(jié)果通過單因素方差分析顯示：5種細(xì)胞株中LMP1的表達(dá)量之間具有顯著性差異(P<0.001)。LMP1在SNK-6、YT、YTS、NK-92、NKL中依次降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示SNK-6細(xì)胞當(dāng)中LMP1的表達(dá)量最高,且高于YT(P<0.001)、YTS(P<0.001)、NK

9、-92(P<0.001)、NKL(P<0.001)細(xì)胞中的表達(dá)；LMP1表達(dá)較高的是YTS細(xì)胞,且高于YT(P<0.05)、NK-92(P<0.00l)、NKL(P<0.001)細(xì)胞中的表達(dá);LMP1在YTS中的表達(dá)高于NK-92(P=0.032)、NKL(P=0.018)，而LMP1表達(dá)較低的NKL與NK-92兩株細(xì)胞之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.741)。對各細(xì)胞系分別給予0、2、4、6、8Gy的放療劑量進(jìn)行照射后，CCK-8及平板克隆

10、形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞放射敏感性顯示YT、SNK-6、YTS、NK-92、NKL的放射敏感性依次增加。YT、SNK-6對放療不敏感，YTS對放療中度敏感，而NK-92、NKL對放療高度敏感，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞中LMP1的表達(dá)量越低，其放射敏感性越高。
　　結(jié)論：
　　LMP1的差異表達(dá)與NK/T細(xì)胞淋巴瘤的放射敏感性負(fù)相關(guān)。
　　第二部分：慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定過表達(dá)及沉默LMP1的NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株的構(gòu)建
　　目的

11、：
　　通過重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建穩(wěn)定高/沉默LMP1的NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株。
　　材料與方法：
　　選擇第一部分所述5種細(xì)胞株中LMP1呈中度表達(dá)而且具有一定侵襲能力的YTS細(xì)胞株，利用慢病毒pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP作為載體，連接LMP1克隆模板PCR產(chǎn)物，形成高表達(dá)慢病毒載體pCDH-LMP1。設(shè)計(jì)并合成三條LMP1基因的shRNA，以干擾慢病毒pLVX-shRNA1為載體，構(gòu)建LMP1基

12、因干擾質(zhì)粒pLVX-LMP1-shRNA a，pLVX-LMP1 shRNA b，及pLVX-LMP1-shRNAc。Real-Time PCR篩選最有效的RNA干擾序列。對過表達(dá)及干擾表達(dá)LMP1的重組質(zhì)粒質(zhì)粒進(jìn)行包裝，濃縮及滴度鑒定，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染淋巴瘤細(xì)胞，測定慢病毒對淋巴細(xì)胞的感染效率。
　　結(jié)果：
　　酶切及測序結(jié)果顯示過表達(dá)LMP1重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-LMP1及干擾表達(dá)LMP1重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-LMP1-

13、shRNA a，pLVX-LMP1 shRNA b，pLVX-LMP1-shRNAc構(gòu)建成功。其中pLVX-shRNAa干擾效率最高，選擇其進(jìn)行第三部分后續(xù)實(shí)驗(yàn)。濃縮后的病毒滴度可達(dá)108IFU/ml。轉(zhuǎn)染YTS細(xì)胞系后，RT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，對相對定量結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)顯示LMP1在pCDH-YTS中的表達(dá)要高于YTS/parental中的表達(dá)(P=0.006)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而LMP1-shRNA-YTS中的表達(dá)要低于YT

14、S/parental中的表達(dá)(P=0.005)。說明瞬時轉(zhuǎn)染對LMP1的表達(dá)產(chǎn)生影響。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)及沉默LMP1的NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞亞株。
　　第三部分：靶向抑制LMP1降低NK/T細(xì)胞淋巴瘤侵襲能力并提高其放射敏感性及機(jī)制分析
　　目的：
　　探討慢病毒介導(dǎo)的LMP1-shRNA干擾表達(dá)載體對NK/T細(xì)胞淋巴瘤放射敏感性的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　采用能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)

15、染傳代6代以上的慢病毒介導(dǎo)干擾LMP1表達(dá)的YTS細(xì)胞亞細(xì)胞株YTS-LMP1-shRNA后進(jìn)行X線照射，采用CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測放療增敏效果，Millicell小室實(shí)驗(yàn)(侵襲實(shí)驗(yàn))檢測侵襲能力變化，Western blot檢測與侵襲相關(guān)TIMP-1、MMP-9蛋白，DNA損傷修復(fù)通路相關(guān)蛋白Ku70、DNA-PKcs以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax等表達(dá)水平的變化，從分子水平分析其放射增敏及抑制侵襲的相關(guān)機(jī)制。
　　

16、結(jié)果：
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，PCDH-LMP1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株與對照組相比,放射敏感性下降(P<0.001)，而LMP1-shRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株與對照組相比，放療敏感性增強(qiáng)(P<0.001)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)4GyX線照射后，LMPl-shRNA轉(zhuǎn)染組存活曲線較其他各組均明顯下降(P<0.01)。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，單純照射組、單純轉(zhuǎn)染shLMP1組、照射+轉(zhuǎn)染shLMP1組均明顯少于對照組（P<0.01）；照射聯(lián)合轉(zhuǎn)染shLMP

17、1組較其余各組，穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P<0.01）。進(jìn)一步分析顯示，除Ku-70外，其他入選蛋白在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中都有或多或少表達(dá)，6GyX線照射可誘導(dǎo)YTS細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)侵襲相關(guān)蛋白MMP-9和相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)降低，DNA損傷修復(fù)蛋白DNA-PKcs表達(dá)增加，而LMPl-shRNA轉(zhuǎn)染可增加放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.01)，并且可上調(diào)YTS細(xì)胞自身和放射誘導(dǎo)的Bax、TIMP-1蛋白表達(dá)(P<0.01)，下調(diào)自身和放射誘