基因治療人類CRB1突變引起的視網(wǎng)膜色素變性的方案探索.pdf

1、目的:
　　感光細(xì)胞退行性病變是人類的一種常見致盲性疾病，嚴(yán)重危害人類健康，但目前針對這類疾病仍沒有良好的醫(yī)療手段。現(xiàn)今，基因治療和干細(xì)胞治療是兩類具有較好前景的治療方案。在人類諸多與視網(wǎng)膜退行性病變相關(guān)的基因當(dāng)中，CRB1基因不同位點(diǎn)的突變可以引起視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP）和利伯氏先天性黑蒙(Leber congenital amaurosis，LCA)，但目前尚未有關(guān)于此基因突變進(jìn)行基因治

2、療的報(bào)道，主要原因之一是CRB1基因比較大，不符合基因治療的載體腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)對基因片段大小的要求，且其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，各結(jié)構(gòu)域的功能尚不十分明確。鑒于此，本論文旨在以斑馬魚為模型，分析其Crb2a蛋白各結(jié)構(gòu)域的功能，在此基礎(chǔ)上探索對人類因CRB1功能缺陷引起的RP和LCA的基因治療方案。
　　方法:
　　首先，通過生物信息學(xué)比較斑馬魚不同Crb異構(gòu)體與哺乳動物CRB

3、1之間的同源性，確定crb2a為斑馬魚中與哺乳動物CRB1同源的基因。然后，對斑馬魚 Crb2a蛋白的各結(jié)構(gòu)域分區(qū)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合對比分析自然界原本存在的不同異構(gòu)體，分別克隆各單個結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域組合，在斑馬魚和細(xì)胞中分別檢測其對crb2a突變魚系表型的修復(fù)情況，介導(dǎo)蛋白——蛋白自身粘連的能力等，以此研究Crb2a各結(jié)構(gòu)域的功能。在此基礎(chǔ)上，選擇基因大小適宜且保留Crb2a功能的重組形式，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在斑馬魚中驗(yàn)證對CRB1突變引起的視網(wǎng)

4、膜疾病進(jìn)行基因治療的可行性。
　　結(jié)果:
　　生物信息學(xué)分析表明，crb2a具有3個Laminin G結(jié)構(gòu)域和16個EGF結(jié)構(gòu)域。同時，盡管自然界中獲得廣泛認(rèn)可的具有功能的Crb蛋白通常由以上結(jié)構(gòu)域組成，但cDNA克隆表明crb2a具有多種不同的剪接轉(zhuǎn)錄形式。在此基礎(chǔ)上，我們通過基因工程技術(shù)，獲得了8種不同結(jié)構(gòu)域組合的重組crb2a。經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成mRNA后，顯微注射到斑馬魚胚胎中，觀察是否能修復(fù)crb2a突變魚系表型。結(jié)果證