IVF-ET周期中不同原核數(shù)受精卵的發(fā)育潛能及其囊胚染色體組成的實驗研究.pdf

1、背景與目的:在人類體外授精-胚胎移植（in vitro fertilization embryo transfer，IVF-ET）助孕過程中，國內(nèi)外的大多數(shù)生殖中心一般于授精后16～18h對胚胎行原核數(shù)目的觀察和評價。胚胎學家們通過對大量工作進行總結(jié)后普遍認為，正常受精的胚胎在授精后的16～18h可觀察到明確存在的2個原核（pronucleus，PN）及2個極體（polar body，PB）。隨后再結(jié)合胚胎的卵裂及整體發(fā)育情況，將那些形

2、態(tài)學評分較高的卵裂期胚胎或囊胚挑選出來，進行移植或者冷凍。而在實際的胚胎實驗室工作中，往往會出現(xiàn)一些異常受精胚胎，其中1PN胚胎和0PN(2PB)胚胎作為異常受精的胚胎，與多原核胚胎和發(fā)育停滯的2PN胚胎一起作為廢棄胚胎銷毀。實際上，有一定比例的1PN及0PN(2PB)胚胎可能是因為錯過了最適宜的觀察時間導致。如果把這兩類胚胎全部銷毀，將在一定程度上造成卵母細胞及胚胎資源的浪費。已有不少報道指出，有相當一部分的不孕癥患者移植1PN胚胎及

3、0PN(2PB)胚胎后生育出健康的子代。
　　在IVF-ET助孕過程中，挑選出健康的胚胎進行移植是成功妊娠的關(guān)鍵所在。近年來，隨著遺傳學診斷方法的不斷發(fā)展，植入前胚胎的染色體診斷技術(shù)得到了長足的發(fā)展，最主要的是胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）及胚胎植入前遺傳學篩查（preimplantation genetic screening，PGS）。目前，用于PGD及PGS

4、的實驗技術(shù)主要有熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、微陣列比較基因組雜交分析（array-comparative genome hybridization，array-CGH）、單核苷酸多態(tài)微陣列技術(shù)（single nucleotide polymorphism microarray，SNP-microarray）和第二代測序法（next generation sequen

5、cing，NGS）。其中array-CGH具有高效率、高通量、高精度、低消耗等特點，已在PGS臨床工作中得到了廣泛的應用。
　　本研究的開展經(jīng)鄭州大學人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準通過，研究進行過程中做到充分尊重患者的知情權(quán)和自主選擇權(quán)。研究通過對787個IVF周期和298個ICSI周期患者的胚胎培養(yǎng)情況及基本資料進行分析，探討1PN胚胎及0PN(2PB)胚胎這類“異常受精”胚胎的發(fā)育潛能及與形成這兩類胚胎的可能影響因素。并觀察研究中

6、IVF周期患者胚胎的原核情況及卵裂情況，并將其體外培養(yǎng)至囊胚階段（最多培養(yǎng)至第6日），觀察其囊胚形成情況，檢測0PN(2PB)、1PN及2PN囊胚的染色體組成，以探尋選擇高發(fā)育潛能的1PN及0PN(2PB)胚胎的方法。
　　材料和方法:
　　本研究選取了鄭州大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學研究所自2014年7月至2014年10月行IVF-ET助孕的患者（IVF周期數(shù)=787；ICSI周期數(shù)=298），經(jīng)患者知情同意后，觀察并記錄其胚胎繼

7、續(xù)培養(yǎng)情況，探討1PN及0PN(2PB)胚胎這類“異常受精”胚胎的發(fā)育潛能，同時分析這些患者的臨床資料，研究與1PN及0PN(2PB)胚胎形成的相關(guān)影響因素。同時對787個IVF周期患者的胚胎于體外培養(yǎng)至第6日，觀察其囊胚形成情況。取囊胚滋養(yǎng)層細胞進行活檢，采用微陣列比較基因組雜交分析(array-CGH)檢測0PN(2PB)、1PN及2PN來源囊胚的染色體組成（其中2PN囊胚來源于同期行PGS助孕的患者），以探尋選擇高發(fā)育潛能的1PN

8、及0PN(2PB)胚胎的方法。
　　采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結(jié)果用x±s（均數(shù)±標準差）或中位數(shù)（最小值-最大值）表示，組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用?2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.不同原核數(shù)來源胚胎發(fā)育潛能的比較
　　1PN來源胚胎和0PN(2PB)來源胚胎均可卵裂并形成囊胚，但卵裂率（分別為90.16％和88.11

9、%）和囊胚形成率（分別為17.09%和30.03%）均顯著低于2PN胚胎（卵裂率和囊胚形成率分別為98.40%和45.71%），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明1PN及0PN(2PB)來源胚胎有一定的發(fā)育潛能，但較2PN胚胎的發(fā)育潛能低。
　　2.女方年齡與不同原核數(shù)胚胎形成之間的關(guān)系
　　根據(jù)患者的年齡對患者進行分組，界值為30歲、35歲。與>35歲組的患者相比較，30-35歲組患者的2PN胚胎卵裂率、0PN(2PB

10、)胚胎形成率及其卵裂率較高，且差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05），而2PN胚胎的形成率、1PN胚胎形成率及其卵裂率則無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。<30歲組患者與>35歲組患者比較后，只有0PN(2PB)胚胎的卵裂率較高，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其他各項之間則無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　3.體外受精方式與不同原核數(shù)胚胎形成的關(guān)系
　　常規(guī)IVF周期中，患者的平均獲卵數(shù)、1PN胚胎形成率和0PN(2PB)胚

11、胎形成率均高于ICSI周期（3.65%vs.3.01%，P<0.05；4.93%vs.1.07%，P<0.05）；而兩組之間的1PN胚胎及0PN(2PB)胚胎的卵裂率（90.16%vs.92.96%，P＞0.05；88.11%vs.84.0%，P＞0.05）及囊胚形成率（17.09%vs.7.58%，P＞0.05；30.03%vs.14.29%，P＞0.05）并無顯著性差異。
　　4.不同獲卵數(shù)對不同原核數(shù)胚胎形成的關(guān)系
　

12、　根據(jù)患者的獲卵數(shù)對患者進行分組，界值分別為5、10、15、20。各組患者的1PN胚胎形成率、卵裂率以及0PN(2PB)胚胎的形成率之間，并無統(tǒng)計學差異（P>0.05)，但各組之間的2PN胚胎形成率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率以及0PN(2PB)胚胎卵裂率則存在顯著性的差異（P<0.05）。
　　5.采用Logistic回歸分析研究1PN及0PN(2PB)胚胎形成的相關(guān)影響因素
　　分別以是否有1PN胚胎形成和是否有0PN(2PB)

13、胚胎形成為因變量，納入患者的年齡、基礎性激素（FSH、LH、E2、P、T、PRL）水平、體重指數(shù)（Body Mass Index，BMI）、受精方式（IVF/ICSI）、獲卵數(shù)、MⅡ卵子數(shù)和正常受精胚胎數(shù)為自變量，行Logistic回歸分析，檢驗水準定為α=0.05，若P＜0.05則認為組間的差異存在統(tǒng)計學意義。
　　Logistic回歸分析的結(jié)果顯示，1PN胚胎及0PN(2PB)胚胎的形成均與患者的受精方式、MⅡ卵子數(shù)、2PN胚

14、胎數(shù)顯著相關(guān)（P<0.05），而與患者的年齡、基礎性激素水平、BMI和獲卵數(shù)等無關(guān)（P>0.05）。另外，與ICSI周期相比較而言，IVF周期更可能形成0PN(2PB)及1PN胚胎（P<0.05）。當患者的MⅡ卵數(shù)越多，2PN胚胎數(shù)越少時，越易形成1PN胚胎和0PN(2PB)胚胎（P<0.05）。
　　6.IVF周期不同原核數(shù)來源囊胚染色體組成的比較
　　對787個IVF周期患者的胚胎進行體外培養(yǎng)，觀察其原核數(shù)目、卵裂情況及

15、囊胚的形成情況。采用囊胚滋養(yǎng)層細胞活檢+array-CGH技術(shù)對形成的囊胚行染色體檢測，檢測結(jié)果顯示：與2PN來源的囊胚（69.39%）相比，0PN(2PB)及1PN來源囊胚的正常染色體率（64.71%和50.0%）明顯較低，且存在統(tǒng)計學差異（P<0.05)。然而，對0PN(2PB)與1PN來源的囊胚進行比較后發(fā)現(xiàn)，與1PN囊胚相比較，0PN(2PB)囊胚的染色體正常率略高，但兩組間的差異并沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
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16、.不同發(fā)育天數(shù)的不同原核數(shù)來源囊胚的比較
　　對于1PN及0PN（2PB）來源的囊胚而言，D6囊胚比D5囊胚正常染色體比例高，但1PN囊胚組差異有統(tǒng)計學意義（72.22%vs.37.50%，P<0.05)，而0PN（2PB）囊胚組差異無統(tǒng)計學意義（71.79%vs.55.17%，P>0.05)。而2PN囊胚組則與此相反，其D5形成的囊胚較D6形成的囊胚染色體正常的比例略高，并且差異有統(tǒng)計學意義（82.14%vs.52.38%，P<

17、0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.1PN及0PN(2PB)胚胎均有一定的發(fā)育潛能，但較2PN胚胎低；且染色體組成分析顯示，1PN及0PN(2PB)囊胚染色體正常的比例明顯低于2PN囊胚；
　　2.體外受精方式的不同可能導致1PN和0PN(2PB)胚胎的形成率不同，IVF周期較ICSI周期的1PN和0PN(2PB)胚胎形成率高；
　　3.0PN(2PB)囊胚的染色體二倍體率較1PN囊胚高；發(fā)育至D6的0PN(2PB