CGRP在骨修復(fù)與炎癥性骨疾病中的生物學(xué)作用及機制的研究.pdf

1、目的:骨具有修復(fù)再生的獨特能力，這歸于一系列控制骨愈合的細胞和分子參與了這個復(fù)雜的過程并調(diào)控骨骼的生長和發(fā)育。骨修復(fù)中的一個重要組成部分就是骨細胞的行為。骨這種本身存在的緊密耦合對骨骼系統(tǒng)的正常功能及維持至關(guān)重要。
　　骨骼系統(tǒng)的主要功能包括:1.提供對器官組織的支持2.調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)。骨的改建與重構(gòu)過程主要由兩個主要類型的細胞即成骨細胞所帶來的骨形成和破骨細胞造成的骨降解而完成的。這個過程正是由這些細胞的發(fā)展和激活所緊密調(diào)節(jié)的;當(dāng)

2、然，也是由一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)通路所參與介導(dǎo)的。
　　目前，已經(jīng)被證明ERK通路、OPG/RANKL通路、BMP-2/Smads通路和Wnt信號等多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在整個成骨細胞分化增殖過程中都起著重要的作用。但由于這個過程本身較為復(fù)雜，所以具體的調(diào)控機制還不是十分明確。近年來在骨代謝方面，尤其是神經(jīng)分泌的神經(jīng)遞質(zhì)信號對成骨細胞的影響成為了研究熱點，這為研究骨的生長發(fā)育、修復(fù)、以及相關(guān)疾病的治療帶來了新的方向。
　　CGRP受體

3、屬于G蛋白偶聯(lián)家族成員，是由七個跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白即降鈣素受體樣受體(CRLR)和輔助蛋白，受體活性修飾蛋白（RAMP1）。此外，CGRP受體組分蛋白(RCP)作為胞漿蛋白，似乎是有效的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需要的信號。而CGRP正是能激活這種受體相關(guān)的異三聚體的蛋白。
　　進一步的證據(jù)表明CGRP在骨中起著重要作用能影響成、破骨細胞的功能。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細胞過表達CGRP能夠使骨密度增加。此外，在各種成骨細胞系及正常人成骨細胞樣

4、細胞上均發(fā)現(xiàn)CT和CGRP及其受體的mRNA的表達。CGRP還能促進成骨細胞增殖以及胰島素生長因子(IGF)的表達。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP能通過其受體受體刺激c-AMP活性和磷脂酶分別刺激活化蛋白激酶A(PKA)，并增加細胞內(nèi)游離鈣的水平以及蛋白激酶C(PKC)激活。此次研究首先關(guān)注了CGRP受體所介導(dǎo)的誘導(dǎo)成骨分化的功能，明確CGRP在促進骨修復(fù)中的涉及的相關(guān)機制，同時也初步探索了在炎癥性骨疾病中CGRP潛在的保護作用，以期為CGRP的在

5、骨創(chuàng)傷愈合中的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　在研究CGRP受體所介導(dǎo)的誘導(dǎo)成骨分化的功能的試驗中，首先利用慢病毒載體的構(gòu)建，穩(wěn)定敲除了CGRP受體RAMP1的表達，熒光定量PCR，WB，以及免疫熒光檢測敲除RAMP1后對CGRP受體表達的影響。又通過細胞增殖測定，骨分化標志基因的表達的檢測和茜素紅染色等方法，檢測了敲除RAMP1后對CGRP誘導(dǎo)成骨細胞活性和分化的影響。結(jié)果表明，在成骨細胞中敲除RAMP1會導(dǎo)致CRLR表達和在細胞膜分布

6、的抑制。此外，RAMP1的穩(wěn)定敲除會抑制CGRP誘導(dǎo)的細胞增殖和堿性磷酸酶活性，會減少Runx2和Ⅰ型膠原的mRNA的表達以及礦化沉積。還發(fā)現(xiàn)，敲除RAMP1會抑制CGRP刺激的成骨細胞c-AMP的水平。
　　此外，在本次實驗中，還首次探討了CGRP對于LPS誘導(dǎo)成骨細胞凋亡的影響。同時，也在動物實驗中對此進行了驗證，并探討CGRP在LPS誘導(dǎo)的大鼠實驗性牙周炎模型牙周組織中的作用及相關(guān)機制。
　　方法:
　　實驗一<

7、br>　　(1).用不同濃度的CGRP處理MG63細胞1，4，7天后，采用CCK-8法檢測CGRP對成骨細胞增殖活性的影響。檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CGRP能夠顯著增加成骨細胞的增殖活性，且最佳濃度在10-8 M。此外，ALP活性也被檢測。不同劑量的CGRP處理MG63細胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)1，4，7天，茜素紅進行礦化結(jié)節(jié)的染色。
　　(2).穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒以敲除RAMP1的表達，轉(zhuǎn)染后的細胞（Con-shRNA，shRAMP1

8、）的細胞用熒光定量PCR、Western blot及免疫熒光染色檢測RAMP1其他CGRP受體的蛋白和基因水平表達變化和膜分布的變化。
　　(3).CCK-8法檢測Con-shRNA組，shRAMP1處理組的細胞增殖活性。接下來，成骨細胞的分化也同樣用ALP檢測。QPCR檢測成骨細胞的分化標志物Runx2和CollagenⅠ表達。
　　(4).轉(zhuǎn)染后，細胞內(nèi)cAMP水平的變化被檢測。CCK8檢測加入cAMP/PKA信號的激動

9、劑forskolin后的Con-shRNA組、shRAMP1處理的細胞的增殖活性。此外，還檢測了ALP活性以及RUNX2和Collagen ImRNA水平，最后進行了各組的茜素紅染色。
　　實驗二
　　(5).首先檢測了用不同濃度(0-1000ng/ml) LPS作用于MC3T3-E1細胞48h的細胞活性。同時，也檢測了CGRP的處理對MC3T3-E1細胞活性的影響。
　　(6).用或無100nm CGRP預(yù)處理MC3

10、T3-E1細胞30min，再用LPS處理48h，流式細胞儀分析檢測了CGRP對LPS誘導(dǎo)的MC3T3-E1細胞凋亡的影響。與此同時，還用Western blot檢測了CGRP對LPS刺激的Caspase-3剪切蛋白表達的影響。
　　(7).Western blot檢測了CGRP對LPS刺激的ERK信號活化的影響
　　(8).Micro-CT掃描檢測牙周炎模型骨破壞程度，BVF值進行定量分析骨吸收程度。HE染色檢測炎性細胞浸潤

11、;免疫組化染色檢測牙周組織細胞凋亡及caspase3剪切和ERK的表達。
　　總結(jié):
　　(1).CGRP促進成骨細胞的細胞活性和成骨分化能力。
　　(2).RAMP1的表達可以抑制CRLR的表達。
　　(3).敲除RAMP1抑制CGRP誘導(dǎo)的成骨細胞的活性和成骨分化能力。
　　(4).敲除RAMP1抑制CGRP調(diào)節(jié)的分化是通過cAMP/PKA信號途徑。
　　(5).CGRP顯著刺激增加成骨細胞的活力